Kathodolumineszenzbildgebung von Zellstrukturen, die mit lumineszierenden Iridium- oder Rheniumkomplexen markiert sind, bei kryogenen Temperaturen

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 13432 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Wir berichten zum ersten Mal über die Verwendung von zwei Bildgebungsmitteln für lebende Zellen aus der Gruppe der lumineszierenden Übergangsmetallkomplexe (IRAZOLVE-MITO und REZOLVE-ER) als Kathodolumineszenzsonden. Diese erste experimentelle Demonstration zeigt die Anwendung beider Sonden zur Identifizierung zellulärer Strukturen im Nanomaßstab und nahe dem nativen Zustand direkt im Kryo-Rasterelektronenmikroskop. Dieser Ansatz kann möglicherweise auf korrelative und multimodale Ansätze angewendet und verwendet werden, um bestimmte Regionen in verglasten Proben bei niedrigen Elektronenstrahlenergien anzuvisieren.

Die Elektronenmikroskopie zeigt Zellstrukturen in unglaublicher Detailliertheit; Allerdings steckt die spezifische Lokalisierung nanoskaliger Strukturen in ihrer nativen, kryofixierten Umgebung noch in den Kinderschuhen. Die aktuellen Ansätze zur Lokalisierung der Strukturen bei Raumtemperatur umfassen Immun- und Affinitätsgoldmarkierung und seltener chemische Markierung1. Eine weitere Möglichkeit ist der Einbau bioorthogonaler Markierungen, genetisch exprimierter Markierungen oder fluoreszierender Sonden, deren Nachweise mit der Ultrastruktur in derselben Zelle (korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie) mit hochauflösender Mikroskopie und Kryofluoreszenzmikroskopie korreliert werden2,3,4,5. Diese Bildgebungstechnologien, die sich in den letzten Jahren rasant weiterentwickelt haben, liefern erhebliche Fortschritte beim Verständnis der Funktionsweise von Molekülen im strukturellen Kontext.

Hier untersuchen wir die Verwendung von IRAZOLVE-MITO- und REZOLVE-ER-Sonden für die Kathodolumineszenz (CL)-Bildgebung. CL ist die Emission von Photonen aus einem Material als Reaktion auf die Anregung durch beschleunigte Elektronen. Der Nachweis der CL-Emission aus biologischen Proben6,7, organischen Fluorophoren8,9,10, Proteinen und Halbleiterquantenpunkten11 ist äußerst anspruchsvoll, da optische Signale geringer Intensität unter dem Strahl beschleunigter Elektronen aufgrund der strukturellen Schädigung des biologischen Materials schnell weiter ausbleichen Material. Im Gegensatz dazu haben lumineszierende anorganische Nanokristalle (z. B. Nanodiamanten oder mit Seltenerdelementen dotierte Nanokristalle) als helle und stabile CL-Sonden mit schmalen Emissionsspektren zunehmend an Bedeutung gewonnen12,13,14,15,16,17,18. Mit Seltenerdelementen dotierte Nanokristalle können möglicherweise für die korrelative (mehrfarbige) CL-Elektronenmikroskopie nützlich sein. Insbesondere wurden YVO4:Bi3+-, Eu3+- und Y2O3:Tb3-Nanokristalle gleichzeitig mit CL und BSE bei niedrigen Elektronenbeschleunigungsspannungen (≤ 2 kV) in menschlichen Gefäßendothelzellen in Epoxidharzblöcken mithilfe der fokussierten Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie (FIB-SEM) nachgewiesen )19. FIB-SEM wurde zum Nachweis von LaF3:Tb3+-Partikeln in endozytischen Kompartimenten menschlicher Zellen verwendet, die in Epoxidharz eingebettet waren12. Die Nanokristalle (z. B. Y2O3∶Tb3+, Y2O3∶Eu3+, LaF3:Tb3+), die einen Durchmesser von etwa 10 nm haben, zeigten selbst bei einer hohen Beschleunigungsspannung (80 keV, 2 nA) eine bemerkenswerte Beständigkeit des CL-Signals gegenüber der Elektronenstrahlbelichtung , 100 ms/Pixel). Sie behielten die CL-Intensität von mehr als 97 % im Vergleich zur ursprünglichen Intensität für 1 Minute bei20.

Die IRAZOLVE-MITO- und REZOLVE-ER-Sonden wurden für die Zeitrafferbildgebung entwickelt21,22. REZOLVE-ER, chemisch fac-[Re(CO)3(1,10-phenanthrolin)(4-pyridyltetrazolat)], lokalisiert sich spezifisch in der Kernmembran und im endoplasmatischen Retikulum und ermöglicht auch den Nachweis exozytotischer Ereignisse an der Plasmamembran21. IRAZOLVE-MITO (Iridium komplexiert mit cyclometalliertem 2-Phenylpyridin und dem 5-(5-(4-Cyanophen-1-yl)pyrid-2-yl)tetrazolat-Liganden) weist eine hohe Spezifität für Mitochondrien in lebenden Zellen und sein Emissionsspektrum auf liegt im Bereich von 505–625 nm22. Beide Sonden dringen schnell in die Zellmembran ein, weisen eine geringe Zytotoxizität auf, sind resistent gegen Photobleichung und haben im Gegensatz zu organischen Fluorophoren eine lange Lebensdauer des angeregten Zustands zwischen Hunderten von Nanosekunden und Millisekunden23. Die verlängerte Lebensdauer des angeregten Zustands ergibt sich aus der strukturellen Anordnung der Sonden und der Natur der angeregten Triplett-Multiplizität von Ir und Re21,22. Übergangsmetallkomplexe ermöglichen aufgrund der Anwesenheit von D-Block-Metallzentren den Zugang zu neuen Elektronenzuständen. Dies führt zu ihren einzigartigen photophysikalischen und photochemischen Eigenschaften (hohe Beständigkeit gegen Photobleichung, verlängerte Lebensdauer des angeregten Zustands und geringe Zytotoxizität über lange Belichtungszeiten), was diese Sonden für die Langzeitbildgebung lebender Zellen wertvoll macht23,24,25.

Wir verwendeten zunächst holographische Mikroskopie in Kombination mit Fluoreszenz, um in vivo REZOLVE-ER- und IRAZOLVE-MITO-Färbemuster in Vero-Zellen sichtbar zu machen. Die Farbstoffe wurden in Konzentrationen von 50 µM bzw. 20 µM verwendet und entweder 30 Minuten oder über Nacht inkubiert (siehe Hintergrundinformationen). Eine REZOLVE-ER-Färbung wurde im retikulären Netzwerk um den Zellkern herum beobachtet, wohingegen sich IRAZOLVE-MITO in vesikelartigen Strukturen, wahrscheinlich Lysosomen, anreicherte. Bei Zellen, die vor der IRAZOLVE-MITO-Anwendung vorfixiert wurden, änderte sich jedoch das Färbemuster und die körnigen und filamentösen Strukturen, die sich durch die Zellen erstreckten, wurden markiert (Abb. 1). Eine ähnliche Beobachtung wurde bei Vero-Zellen beobachtet, die mit dem mitochondrialen Farbstoff MITOBLUE (fluoreszierendes Bisbenzamidin-Derivat)26 gefärbt wurden.

REZOLVE-ER- und IRAZOLVE-MITO-Sonden wurden zur Bildgebung des endoplasmatischen Retikulums bzw. der Mitochondrien von Vero-Zellen verwendet. Holographisches Mikroskop 3D Cell Explorer (Nanolive). Balken 20 µm. RI (der Brechungsindex).

Die CL-Bildgebung wurde an gefärbten, unter hohem Druck gefrorenen Zellen durchgeführt, die vor der Beobachtung mittels Kryo-Rasterelektronenmikroskopie (Kryo-SEM) eingefroren wurden. Wir fanden heraus, dass REZOLVE-ER (Abb. 2, linkes Feld) und IRAZOLVE-MITO (Abb. 3) ein starkes CL-Signal aufweisen, das eng mit der Fluoreszenz übereinstimmt (Abb. 1).

REM von gefriergebrochenen Vero-Zellen, gefärbt in vivo mit REZOLVE-ER. Entsprechende Bilder wurden mit dem Crytur-Kathodolumineszenzdetektor (CL) und dem Everhart-Thornley-Detektor (SE) bei –140 °C und 5 keV aufgenommen. Das CL-Bild wurde koloriert und mit dem SE-Bild zusammengeführt, um die genaue strukturelle Überlagerung zu veranschaulichen. Das CL-Signal half dabei, die Positionen der gefärbten Zellen im Bruchbereich zu finden und markierte Zellkompartimente zu identifizieren. Der Pfeil markiert die intakte Zelle. SEM JEOL 7401F. Balken: 10 µm.

Korrelative Kryo-Kathodolumineszenz (CL)-Rasterelektronenmikroskopie von mit IRAZOLVE-MITO gefärbten Vero-Zellen. (A–E) In vivo gefärbte Zellen wurden eingefroren, gebrochen und bei –135 °C mit dem Crytur CL-Detektor (4 keV) und dem Everhart-Thornley-Detektor (ETD, 1 keV) abgebildet. (F–H) Chemisch vorfixierte Zellen wurden gefärbt, bei hohem Druck eingefroren und entsprechende Bilder wurden bei 4 keV unter Verwendung von CL (F) und ETD (G) aufgenommen. Balken: 1 µm (A–E), 10 µm (F–H). SEM JEOL 7401F. CL- und topografische Bilder wurden manuell zusammengeführt (A,H).

Im Kryo-SEM ermöglichte CL eine schnelle Kartierung gefärbter Organellen über große Bereiche und ermöglichte die Unterscheidung von intakten Zellen, die im vitrifizierten Medium eingebettet waren, was die Navigation zu den interessierenden Regionen erleichterte. Bei geringer Vergrößerung zeigte CL deutlich die Form der Zellen und die Position der Kerne. Die aufeinanderfolgenden Sekundärelektronenbilder lieferten topografische Daten der Probe, die die Identifizierung zusätzlicher Organellen ermöglichten (Abb. 2, linkes Feld; Abb. 3D, E). Da die Erfassungsparameter für die topografischen (1 kV) und CL-Messungen (4 kV) nicht übereinstimmten, wurde die Registrierung manuell anhand definierter Orientierungspunkte durchgeführt. Ungefärbte Zellen wurden als Negativkontrollen verwendet, um zu bestätigen, dass die zur Visualisierung von IRAZOLVE-MITO und REZOLVE-ER verwendeten Einstellungen kein endogenes CL erkennen ließen (Daten nicht gezeigt).

Unser Ziel war es auch herauszufinden, wie sich die einzelnen Schritte des herkömmlichen REM-Vorbereitungsprotokolls bei Raumtemperatur auf das CL-Signal auswirken. Im Gegensatz zu gefrorenen, hydratisierten Zellen (Abb. S1A) zeigten Aldehyd-fixierte Zellen, die mit organischen Lösungsmitteln (Ethanol, Aceton) bei Raumtemperatur dehydriert wurden, kein CL-Signal. Das CL-Signal blieb nach Lufttrocknung (oder Rotationspumpentrocknung) teilweise erhalten; Es bleicht jedoch fast sofort unter der Elektronenstrahlanregung aus (Abb. S1B, C).

Der CL wurde unabhängig voneinander mit zwei verschiedenen CL-Detektoren erfasst: dem Crytur CL-Detektor (Abb. 2, 3, Abb. S1, S3, S5) oder dem MonoCL4 + CL-Detektor von Gatan (nur Abb. S2), montiert am SEM Magellan 400L , wo wir auch die CL-Emissionsspektren bei 5 kV, 0,1 nA und − 140 °C gemessen haben. Das CL-Spektrum der REZOLVE-ER-Färbung zeigte eine dominante anfängliche Emissionsbande mit dem Zentrum um 550 nm (Abb. 4A), die einem Emissionsprofil für REZOLVE-ER zwischen 500 und 650 nm entsprach27. Die dominierende CL-Emissionsbande von IRAZOLVE-MITO lag im 520-nm-Bereich (Abb. 4B). Allerdings könnte die absorbierte Elektronendosis, die während der seriellen CL-Spektralaufnahme linear anstieg, die Iridiumkomplexe ausbleichen und somit die Aufnahme von Spektren bei längeren Wellenlängen beeinträchtigen. Das bei 403 nm angeregte IRAZOLVE-MITO hatte ein Emissionsintervall von 505 bis 625 nm24. Beide CL-Emissionsmaxima wurden bei -140 °C erhalten und sind im Vergleich zu den bei Raumtemperatur erhaltenen Lumineszenzemissionsmaxima vermutlich blauverschoben. Die Blauverschiebung der Lumineszenzemissionsmaxima organometallischer Komplexe, die bei –196 °C gegenüber Raumtemperatur erhalten wurden, wurde bereits früher beobachtet und mit dem rigidochromen Effekt erklärt27.

Die CL-Emissionsspektren der Sonden REZOLVE-ER (A) und IRAZOLVE-MITO (B) sind in Türkis dargestellt. (A) Zum Vergleich: Das Absorptions-/Emissionsspektrum von REZOLVE-ER beträgt laut Datenblatt 350–405 nm/500–650 nm (grün). Die breite Emissionsbande von IRAZOLVE-MITO in CH2Cl2 liegt bei ~ 605 nm24. CL-Emissionsspektren wurden mit dem MonoCL4-Detektor bei –135 °C gemessen. Es dominierten Bands bei ca. 550 nm für REZOLVE-ER (A) und 525 nm für IRAZOLVE-MITO-Farbstoff (B).

Die niedrigste Beschleunigungsspannung, die die CL-Emission beider Sonden erzeugte, betrug 2 kV; Das optimale Signal-Rausch-Verhältnis wurde jedoch bei 4–5 kV (Abb. S3A) und 30–300 pA Sondenströmen (Abb. S3B, C) erreicht.

Bei diesen Parametern haben wir die räumliche und laterale Auflösung des CL-Signals basierend auf der Monte-Carlo-Simulation der Elektronenstreuung geschätzt. Die Simulationen ermöglichen die quantitative Abschätzung der CL-Erzeugung in einer Massenprobe (hier amorphes Eis als überwiegender Teil einer biologischen Probe) innerhalb des Elektronenwechselwirkungsvolumens (Abb. S4A). Die höchste CL-Intensität um die tatsächliche Strahlposition herum nimmt mit zunehmendem Radius erheblich ab, interferiert jedoch immer noch mit Hunderten von nm mit erheblichem Hintergrund (Abb. S4B). Auf der Z-Achse haben wir geschätzt, dass der Großteil des CL-Signals in Tiefen um 250 nm unter der Oberfläche erzeugt wird. Dies ist durch ein deutlich höheres bestrahltes Volumen gegeben, auch wenn weniger als 20 % der anfänglichen Strahlintensität diese Tiefe erreichen. In der xy-Ebene wird der größte Teil des Signals (mehr als 60 %) aus einem Radius < 8 nm erzeugt (simulierter Strahldurchmesser beträgt 4 nm). Diese theoretischen Werte werden stark durch Probeninhomogenitäten, die Verteilung von CL-emittierenden Partikeln/Verbindungen oder die Lichtbrechung/-absorption in realen Proben beeinflusst. Die Auflösung kann nur durch eine Verringerung der Primärstrahlenergie oder durch die Verwendung einer elektronendurchlässigen Probe verbessert werden, bei der die charakteristische Birnenform der Elektronenwechselwirkung noch nicht vollständig entwickelt ist. Die nächsten limitierenden Faktoren sind die Empfindlichkeit des CL-Detektors, der Arbeitsabstand und die Stabilität der Proben unter dem Elektronenstrahl.

Unter ausgewählten Parametern (4 kV, 15 µs, 300 pA, − 140 °C) verglichen wir den Abfall des CL-Signals aus Intensitätsprofilen, die an den IRAZOLVE-MITO-gefärbten Strukturen ohne und mit Goldsputterbeschichtung (~ 2 nm) gemessen wurden ( Abb. 5). Aus Messungen der CL-Intensitäten über 25 unbeschichtete CL-Bereiche aus dem ersten und den folgenden drei REM-Bildern haben wir die mittlere Pixelintensität für jedes Bild berechnet (Bereich 6 wurde ausgeschlossen, siehe Abb. 5A; Abb. S5).

Abklingen der Kathodolumineszenzintensitäten des IRAZOLVE-MITO-Farbstoffs (ohne und mit gesputterter Goldnanoschicht), gemessen an vier aufeinanderfolgenden Bildern, die mit den gleichen Parametern des CL-Detektors und des SEM (4 keV, 15 µs, 300 pA, 10.367 px/nm) aufgenommen wurden. (A) Die Grafik zeigt Änderungen der CL-Intensitäten, die beim ersten und den folgenden drei Scans gemessen wurden. (B) Die CL-Intensitäten wurden über den repräsentativen unbeschichteten Bereich (Bereich 25 aus Abb. S5 A ist dargestellt) vom ersten bis zum vierten Bild (von links nach rechts) gemessen. Die blaue Ebene stellt die Höhe des Hintergrundmittelwerts dar.

Wir fanden heraus, dass das CL-Signal zwischen der Aufnahme des ersten und des zweiten REM-Bildes in unbeschichteten Proben um ~ 7,4 %, dann um ~ 3,4 % und ~ 5,5 % auf den Wert von ~ 83,8 % (das vierte REM-Bild) abnahm (Abb. 5A, links). Bei den beschichteten Proben sank der CL um ~ 5,4 %, dann um ~ 3,2 % und dann um ~ 4,8 % auf den Wert von ~ 86,7 % (Abb. 5B, rechts). Die Graustufenintensitäten eines ausgewählten Bereichs sind in Abb. 5B dargestellt. Im Vergleich dazu bleichen organische Fluorophore unter dem Elektronenstrahl (2 kV, 0,8 nA, entsprechend einer Dosis von 0,04 nC/μm2) fast sofort aus19. Quantenpunkte (CdSe/CdS) zeigten innerhalb der ersten 10 s eine stark reduzierte CL-Emission (um 30 %) (entspricht einer Dosis von 0,08 nC/μm2), wohingegen der Rückgang der Emissionsintensität von mit Seltenerdelementen dotierten Nanokristallen 10 betrug –20 % innerhalb der ersten 10 s (entspricht einer Dosis von 0,04 nC/μm2)19.

Hier haben wir gezeigt, dass die Farbstoffe IRAZOLVE-MITO und REZOLVE-ER21,22 ein CL-Signal erzeugen, das für korrelative Studien verwendet werden kann, die Live- und CL-SEM-Bildgebung bei kryogenen Temperaturen kombinieren. Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass Lokalisierungsstudien und Strukturbilder bei kryogenen Temperaturen einfach in einem REM-Gerät durchgeführt werden können, ohne dass mehrere Probentransfers erforderlich sind, die für nicht integrierte Kryo-Fluoreszenz-REM-Workflows typisch sind4,5. Der Kryo-CL-SEM-Bildgebungsansatz kann das Potenzial des CL freisetzen, Moleküle im Zellvolumen mithilfe der Kryo-FIB-SEM- und Kryo-Block-Face-Bildgebungstechniken zu lokalisieren, und er kann eine Alternative zur integrierten kryokorrelativen Fluoreszenz-Elektronenmikroskopie sein Arbeitsablauf (z. B. „iCorr“ oder Photon-Ionen-Elektronen-Mikroskop)28,29.

Im Gegensatz zu mit Seltenerdelementen dotierten Nanokristallen und Nanodiamanten, die hauptsächlich zur spezifischen Markierung von Komponenten im Endozytoseweg verwendet werden, wurden IRAZOLVE-MITO und REZOLVE-ER für die Biobildgebung als alternative organellenspezifische Farbstoffe entwickelt. Die weit verbreitete Anwendung von CL in der Bio-Bildgebung wird derzeit durch die Verfügbarkeit hochintensiver CL-Sonden, die auf interessierende Strukturen abzielen, ihre unzureichende Stabilität unter dem Elektronenstrahl und das Fehlen von Sonden mit ausgeprägten Emissionsspektren, die mehrfarbige CL-SEM ermöglichen würden, begrenzt. Die CL-Eigenschaften müssen auch für IRAZOLVE-ALKYNE- und REZOLVE-ALKYNE-Tags sowie andere neuartige photolumineszierende Iridium- oder Rheniumkomplexe getestet werden, die inzwischen gut etablierte Sonden sind, die in der biowissenschaftlichen Forschung eingesetzt werden23,30,31,32. Zum Beispiel Rhenium(i)-tricarbonylkomplexe, die 1,10-Phenanthrolin oder das 3-Chlormethylpyridylbipyridin enthalten, die sich in Mitochondrien ansammeln33,34, ein Rheniumkomplex, der an 4-Cyanophenyltetrazolat (im Handel erhältlich als REZOLVE-L1) gebunden ist und eine Affinität zu aufweist polare Lipide (insbesondere Phosphatidylethanolamin, Sphingomyelin, Sphingosin) und schließlich ein Rhenium-3-Pyridyltetrazolat-Komplex, der innerhalb der Lysosomen lokalisiert ist34. Eine weitere neue Sonde, ein cyclometallierter Iridiumkomplex, wurde entwickelt, um Mikrotubuli durch Licht- und Elektronenmikroskopie sichtbar zu machen35. Phosphoreszierende metallorganische Iridiumkomplexe wurden kürzlich auch zum Nachweis der Lebensfähigkeit von Kieselalgen verwendet36. Andere Lumineszenzsonden umfassen Iridium(III)-Polypyridin-Komplexe37, die bei längerer Laserbestrahlung eine photozytotoxische Aktivität zeigen38.

Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass Lumineszenzsonden aus der Gruppe der Iridium- und Rheniumkomplexe, IRAZOLVE-MITO und REZOLVE-ER, bei niedrigen Elektronenstrahlenergien nachweisbare CL-Signale in verglasten Proben erzeugen. Wir haben CL- und Topographie-Bildgebung an gefriergebrochenen Zellen durchgeführt und festgestellt, dass die CL-Intensität des IRAZOLVE-MITO-Farbstoffs zwischen der ersten und vierten CL-Bildaufnahme derselben Region bei unbeschichteten Proben um 16 % und bei beschichteten Proben um 13 % reduziert war − 140 °C, 4 kV, 300 pA und 15 µs. Da die CL-Bildgebung problemlos in die simultane multimodale Bildgebung des modernen REM integriert werden kann, glauben wir an das große Potenzial der Verwendung organellenspezifischer Sonden wie IRAZOLVE-MITO und REZOLVE-ER in der hochauflösenden biologischen Bildgebung. Die Farbstoffe können verwendet werden, um Zielregionen vor dem Kryo-FIB-Fräsen auszuwählen oder ein korrelatives CL-SEM durchzuführen, wie in dieser Studie gezeigt.

Menschliche Atemwegsepithelzellen A549 wurden in DMEM-Medium mit niedrigem Glucosegehalt mit 10 % fötalem Rinderserum, 1 % ATB (Penicillin, Streptomycin) und 1 % Glutamin kultiviert. Stabil bei 37 °C und 5 % CO2. Zellkulturen von Vero E6 wurden in FLUOROBRITE DMEM-Medium mit hohem Glucosegehalt mit ATB bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Die Zellen wurden in 25-cm2-Gewebekulturflaschen oder in einer µ-Dish 35-mm-Bildgebungskammer mit Glasboden (Ibidi) ausgesät, um eine Konfluenz von 80–100 % zu erreichen. REZOLVE-ER und IRAZOLVE-MITO (beide ReZolve Scientific, weitere Einzelheiten siehe Danksagung) wurden in DMSO auf 10 mM (Stammlösungen) gelöst. Die Zellen wurden in Gegenwart von Kulturmedien durch Zugabe von entweder der REZOLVE-ER-Stammlösung (bis zu Endkonzentrationen von entweder 33 oder 50 µM) oder IRAZOLVE-MITO (20 µM, 40 µM) gefärbt. Die Zellen wurden in vivo mit einem holographischen Mikroskop 3D Cell Explorer (Nanolive) entweder nach 30-minütiger Inkubation oder über Nacht abgebildet. Im Fall der IRAZOLVE-MITO-Färbung wurden die Zellen nach 1-stündiger Fixierung in 4 % Formaldehyd in 0,1 M HEPES bei Raumtemperatur gefärbt und abgebildet, gefolgt von einem 30-minütigen Waschschritt.

Pelletierte Zellen wurden in Gegenwart von 20 % Rinderserumalbumin unter Hochdruck eingefroren (EM ICE, Leica Microsystems) und in das Rasterelektronenmikroskop (REM) JEOL 7401F (JEOL Ltd.) übertragen, das mit einem Kryoaufsatz CryoALTO 2500 (Gatan, Inc.) auf − 140 °C vorgekühlt. Die Zellen wurden gefriergebrochen, optional 10 s lang bei Temperaturen zwischen –98 °C und –95 °C gefriergeätzt und 10 s lang mit Gold (~ 2 nm) vergoldet. Die Bilder wurden mit dem Everhart-Thornley-Detektor für Sekundärelektronen und dem von Crytur comp. entwickelten CL-Detektor aufgenommen. Der CL-Detektor erkennt panchromatische CL-Signale mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis im Spektralbereich 330–600 nm. Dieser versenkbare CL-Detektor vom Parabolspiegeltyp besteht aus einem Quarzlichtleiter und dem Photomultiplier. Die Kontrast- und Helligkeitseinstellungen des CL-Detektors während der CL-Intensitätsmessungen waren konstant.

Die unabhängige Beobachtung wurde mit dem SEM Magellan 400L (ThermoFisher Scient.), ausgestattet mit MonoCL4 + CL-Detektor (Gatan, Inc.), in einem Temperaturbereich von –125 °C bis –150 °C durchgeführt. Die Gefrierfrakturierung und Au/Pt-Beschichtung (ca. ~ 2,7 nm) wurde mit dem Sputtercoater Leica ACE 600 (Leica Microsystems) durchgeführt. CL-Bilder und -Spektren wurden bei einer Strahlenergie von 7 keV und einem Sondenstrom von 0,1 nA aufgenommen.

In vivo mit IRAZOLVE-MITO gefärbte Zellen wurden entweder 15 Minuten oder über Nacht in 4 % Formaldehyd und 0,1 % Glutaraldehyd in 0,1 M HEPES fixiert. Nach dem Waschen wurden die Zellen mit abgestuften Acetonreihen dehydriert, gefolgt von zwei Wäschen in 100 % Aceton. Nach dem Trocknen am kritischen Punkt wurden die Glasdeckobjektträger auf Stubs montiert und 10 s lang mit Gold (Baltec SCD 050) beschichtet. Gefärbte und fixierte Zellen wurden optional an der Luft getrocknet oder mit einer Rotationspumpe ohne Dehydrierung getrocknet.

Zuerst haben wir mit den gleichen Parametern (4 keV, 15 µs, 300 pA) vier aufeinanderfolgende Bilder von Vero-Zellen aufgenommen, die in vivo mit IRAZOLVE-MITO-Farbstoff ohne Beschichtung oder mit Goldbeschichtung (~ 2 nm) gefärbt wurden, wobei der Crytur CL-Detektor montiert war nach SEM JEOL 7401F bei − 140 °C. Intensitäten und Zerfall von CL wurden anhand von Bildern mit dem Matlab-Tool analysiert, wie in Abb. S5 dargestellt. Die Zentren mit den höchsten CL-Intensitäten aus 25 Bereichen der unbeschichteten Probe und 9 Bereichen der goldbeschichteten Probe wurden mit FAST-PEAK-FIND39 (Abb. S5A) erkannt, wobei ein Schwellenwertparameter von 145 manuell aus dem Maximum bestimmt wurde Intensität der Zellen im Hintergrund. Zur weiteren Analyse schneiden wir jeden Bereich mit den höchsten CL-Intensitäten aus dem Bild auf einen quadratischen Bereich mit einer Größe von 21 × 21 px aus (Abb. S5B). Für jeden Bereich haben wir den Durchmesser des Kreises bestimmt, der die CL-Region definiert (in Abb. S5B rot markiert), als Maximum der zweiten Ableitung (in Abb. S5D rot markiert), die aus den in konzentrischen Kreisen berechneten Durchschnittsintensitäten mit steigender Tendenz erhalten wurde Durchmesser, wobei der Mittelpunkt in der Mitte dieser quadratischen Fläche liegt (Abb. S5B, C). Die gesamte CL-Intensität wurde aus dieser internen CL-Region berechnet und statistisch analysiert (Abb. S5E), während die äußeren Bereiche den Hintergrund darstellten (Abb. S5F). Die CL-Intensitäten wurden über die Zeit aufgetragen (vier aufeinanderfolgende Fotos), wobei der erste Wert 100 % darstellt (Abb. 5).

Die für amorphes Eis und eine Strahlenergie von 4 keV in einer Massenprobe simulierte CL-Auflösung wurde in Casino 2.540 berechnet.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten.

Kathodolumineszenz

Rasterelektronenmikroskopie

Tabata, S. et al. Elektronenmikroskopischer Nachweis einzelner Membranproteine durch spezifische chemische Markierung. iScience 22, 256–268. https://doi.org/10.1016/j.isci.2019.11.025 (2019).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bakkum, T. et al. Bioorthogonale korrelative Licht-Elektronenmikroskopie von Mycobacterium tuberculosis in Makrophagen zeigt die Wirkung von Antituberkulose-Medikamenten auf die subzelluläre Bakterienverteilung. ACS Cent. Wissenschaft. 6, 1997–2007. https://doi.org/10.1021/acscentsci.0c00539 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kaufmann, R. et al. Hochauflösende Mikroskopie mit Standard-Fluoreszenzproteinen in intakten Zellen unter Kryobedingungen. Nano Lett. 14, 4171–4175. https://doi.org/10.1021/nl501870p (2014).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Strnad, M. et al. Korrelative Kryofluoreszenz- und Kryo-Rasterelektronenmikroskopie als einfaches Werkzeug zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen. Wissenschaft. Rep. 5, 18029. https://doi.org/10.1038/srep18029 (2015).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vancová, M. et al. Pleomorphismus und Lebensfähigkeit des Lyme-Borreliose-Erregers Borrelia burgdorferi unter physiologischen Stressbedingungen: Eine korrelative Kryofluoreszenz- und Kryo-Rasterelektronenmikroskopie-Studie. Vorderseite. Mikrobiol. 8, 596–596. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.00596 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Pease, RFW & Hayes, TL Rasterelektronenmikroskopie von biologischem Material. Natur 210, 1049–1049. https://doi.org/10.1038/2101049a0 (1966).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Zielinski, MS et al. Quantitative intrinsische Autokathodolumineszenz kann spektrale Signaturen der gewebeisolierten extrazellulären Kollagenmatrix auflösen. Komm. Biol. 2, 69. https://doi.org/10.1038/s42003-019-0313-x (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

De Mets, M. & Lagasse, A. Eine Untersuchung einiger organischer Chemikalien als Kathodolumineszenzfarbstoffe mit dem Rasterelektronenmikroskop. J. Microsc. 94, 151–156. https://doi.org/10.1111/j.1365-2818.1971.tb03698.x (1971).

Artikel PubMed Google Scholar

Fisher, PJ, Wessels, WS, Dietz, AB & Prendergast, FG Verstärkte biologische Kathodolumineszenz. Opt. Komm. 281, 1901–1908. https://doi.org/10.1016/j.optcom.2007.04.069 (2008).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Akiba, K., Tamehiro, K., Matsui, K., Ikegami, H. & Minoda, H. Die Kathodolumineszenz von grün fluoreszierendem Protein zeigt das rotverschobene Spektrum und die Robustheit. Wissenschaft. Rep. 10, 17342. https://doi.org/10.1038/s41598-020-74367-4 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fern, GR, Silver, J. & Coe-Sullivan, S. Kathodolumineszenz und Elektronenmikroskopie roter Quantenpunkte für Displayanwendungen. J. Soc. Informieren. Anzeige 23, 50–55. https://doi.org/10.1002/jsid.278 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Keevend, K. et al. Tb3+-dotierte LaF3-Nanokristalle für die korrelative Kathodolumineszenz-Elektronenmikroskopie-Bildgebung mit nanometrischer Auflösung in biologischen Proben, die durch fokussierte Ionenstrahlen geschnitten wurden. Nanoskala 9, 4383–4387. https://doi.org/10.1039/C6NR09187C (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nagarajan, S. et al. Gleichzeitige Kathodolumineszenz und elektronenmikroskopische Zytometrie von Zellvesikeln, die mit fluoreszierenden Nanodiamanten markiert sind. Nanoskala 8, 11588–11594. https://doi.org/10.1039/C6NR01908K (2016).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Prigozhin, MB et al. Helle kathodolumineszierende Nanosonden im Sub-20-nm-Bereich für die Elektronenmikroskopie. Nat. Nanotechnologie. 14, 420–425. https://doi.org/10.1038/s41565-019-0395-0 (2019).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Keevend, K. et al. Ultrahelle und stabile Lumineszenzmarkierungen für die korrelative Kathodolumineszenz-Elektronenmikroskopie (CCLEM)-Biobildgebung. Nano Lett. 19, 6013. https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.9b01819 (2019).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Glenn, DR et al. Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie mittels Kathodolumineszenz von Nanopartikeln mit unterscheidbaren Farben. Wissenschaft. Rep. 2, 865–865. https://doi.org/10.1038/srep00865 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Keevend, K., Coenen, T. & Herrmann, IK Korrelative Kathodolumineszenz-Elektronenmikroskopie-Bioimaging: Auf dem Weg zur Markierung einzelner Proteine mit ultrastrukturellem Kontext. Nanoskala 12, 15588–15603. https://doi.org/10.1039/D0NR02563A (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Fukushima, S. et al. Korrelative Nahinfrarotlicht- und Kathodolumineszenzmikroskopie unter Verwendung von Y2O3:Ln, Yb (Ln = Tm, Er) Nanophosphoren für mehrskalige, mehrfarbige Biobildgebung. Wissenschaft. Rep. 6, 25950. https://doi.org/10.1038/srep25950 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Keevend, K. et al. Ultrahelle und stabile Lumineszenzmarkierungen für korrelative Kathodolumineszenz-Elektronenmikroskopie-Bioimaging. Nano Lett. 19, 6013–6018. https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.9b01819 (2019).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Furukawa, T. et al. Mit seltenen Erden dotierte Nanoleuchtstoffe für die mehrfarbige Kathodolumineszenz-Nanobioimaging mittels Rastertransmissionselektronenmikroskopie. J. Biomed. Opt. 20, 056007 (2015).

Artikel ADS Google Scholar

Bader, CA et al. Darstellung von Ereignissen im Zellkern, im endoplasmatischen Retikulum und in der Plasmamembran in Echtzeit. FEBS Lett. 590, 3051–3060. https://doi.org/10.1002/1873-3468.12365 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sorvina, A. et al. Mitochondriale Bildgebung in lebendem oder fixiertem Gewebe mithilfe eines lumineszierenden Iridiumkomplexes. Wissenschaft. Rep. 8, 8191. https://doi.org/10.1038/s41598-018-24672-w (2018).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Caporale, C. & Massi, M. Cyclometallierte Iridium(III)-Komplexe für die Biowissenschaften. Koordin. Chem. Rev. 363, 71–91. https://doi.org/10.1016/j.ccr.2018.02.006 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Caporale, C. et al. Untersuchung der intrazellulären Lokalisierung und Zytotoxizitätstrends für neutrale und kationische Iridiumtetrazolato-Komplexe in lebenden Zellen. Chemie 23, 15666–15679. https://doi.org/10.1002/chem.201701352 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bader, CA et al. Die Modulation der Organellenspezifität in Re(i)-Tetrazolato-Komplexen führt zur Markierung von Lipidtröpfchen. RSC Adv. 4, 16345–16351. https://doi.org/10.1039/C4RA00050A (2014).

Artikel ADS MathSciNet CAS Google Scholar

Sánchez, MI et al. MitoBlue als Werkzeug zur Analyse der Mitochondrien-Lysosomen-Kommunikation. Wissenschaft. Rep. 10, 3528. https://doi.org/10.1038/s41598-020-60573-7 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wright, PJ et al. Synthese, photophysikalische und elektrochemische Untersuchung zweikerniger tetrazolatoverbrückter Rheniumkomplexe. Organometallics 31, 7566–7578. https://doi.org/10.1021/om300870a (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Wang, S., Li, S., Ji, G., Huang, X. & Sun, F. Verwendung integrierter korrelativer Kryolicht- und Elektronenmikroskopie zur direkten Beobachtung von Syntaphilin-immobilisierten neuronalen Mitochondrien in situ. Biophys. Rep. 3, 8–16. https://doi.org/10.1007/s41048-017-0035-x (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gorelick, S. et al. PIE-Scope, integrierte kryokorrelative Licht- und FIB/SEM-Mikroskopie. eLife 8, e45919. https://doi.org/10.7554/eLife.45919 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, Z., Bian, Z. & Huang, C. In Molecular Organometallic Materials for Optics (Hrsg. Hubert, B. & Véronique, G.) 113–142 (Springer, 2010).

Kapitel Google Scholar

Dixon, IM et al. Eine Familie lumineszierender Koordinationsverbindungen: Iridium()-Polyiminkomplexe. Chem. Soc. Rev. 29, 385–391. https://doi.org/10.1039/B000704H (2000).

Artikel CAS Google Scholar

Caporale, C. et al. Photophysikalische und biologische Eigenschaften von mit Fettsäureketten funktionalisierten Iridiumtetrazolato-Komplexen. Inorganics 8, 23 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Amoroso, AJ et al. 3-Chloromethylpyridyl bipyridine fac-tricarbonyl rhenium: Ein thiolreaktiver Luminophor für die Fluoreszenzmikroskopie reichert sich in Mitochondrien an. Neue J. Chem. 32, 1097–1102. https://doi.org/10.1039/B802215A (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Bader, C. et al. Die Modulation der Organellenspezifität in Re(I)-Tetrazolato-Komplexen führt zur Markierung von Lipidtröpfchen als Dolch. RSC Adv. 4, 16345. https://doi.org/10.1039/C4RA00050A (2014).

Artikel ADS MathSciNet CAS Google Scholar

Tian, X. et al. Ein cyclometallierter Iridium(III)-Komplex als Mikrotubuli-Sonde für korrelative hochauflösende Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie. Adv. Mater. 32, 2003901. https://doi.org/10.1002/adma.202003901 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Leone, G. et al. Ein phosphoreszierender Iridiumkomplex als Sonde für die Lebensfähigkeit von Kieselalgenzellen. MRS Adv. 5, 935–941. https://doi.org/10.1557/adv.2020.18 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Siehe, KK-W. Lumineszierende Rhenium(I)- und Iridium(III)-Polypyridinkomplexe als biologische Sonden, Bildgebungsreagenzien und photozytotoxische Wirkstoffe. Acc. Chem. Res. 48, 2985–2995. https://doi.org/10.1021/acs.accounts.5b00211 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yip, A. & Lo, KK-W. Lumineszierende Rhenium(I)-, Ruthenium(II)- und Iridium(III)-Polypyridinkomplexe mit einer anhängenden oder bioorthogonalen Reaktionsgruppe aus Poly(ethylenglykol) als biologische Sonden und photozytotoxische Wirkstoffe. Koordin. Chem. Rev. 361, 138–163. https://doi.org/10.1016/j.ccr.2018.01.021 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Natan. „Schneller 2D-Peak-Finder.“ Zentraler Matlab-Dateiaustausch. https://es.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/37388-fast-2d-peak-finder?s_tid=FX_rc1_behav (abgerufen am 8. Juli 2021). (2021).

Drouin, D. et al. CASINO V2.42: Ein schnelles und benutzerfreundliches Modellierungstool für Benutzer der Rasterelektronenmikroskopie und Mikroanalyse. Scannen 29, 92–101. https://doi.org/10.1002/sca.20000 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

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Wir danken der Firma Crytur für die Möglichkeit, ihren CL-Detektor zu nutzen, Jiří Vaněček (BC CAS) und Marek Dolejší (Universität Südböhmen, USB, České Budějovice) für die fachkundige technische Unterstützung beim SEM, Eva Výletová (USB) für die Bereitstellung von Menschen Atemwegsepithelzellen, Schenkung von R. Randall, University of St. Andrews, UK. Die zuvor von ReZolve Scientific vertriebenen IRAZOLVE-MITO- und REZOLVE-ER-Färbesonden wurden freundlicherweise von Prof. Sally Plush (University of South Australia; [email protected]) und Prof. Max Massi (von der Curtin University, Perth, Australien, und ReZolve comp.; [email protected]); Um sich über die Verfügbarkeit der Sonden und eine mögliche Zusammenarbeit zu erkundigen, wenden Sie sich bitte über die angegebenen E-Mail-Adressen an Sally Plush und Max Massi.

Diese Arbeit wurde von der Technologieagentur der Tschechischen Republik (TN0100008), dem Ministerium für Bildung, Jugend und Sport der Tschechischen Republik (Czech BioImaging LM2018129) und dem Europäischen Fonds für regionale Entwicklung – Projekt „Mechanismen und Dynamik makromolekularer Komplexe“ – unterstützt : vom einzelnen Molekül zur Zelle“ (Nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/15_003/0000441).

Institut für Parasitologie, Biologiezentrum CAS, České Budějovice, 37005, Tschechische Republik

Marie Vancová, Eva Ďurinová, Tomáš Bílý & Jana Nebesářová

Fakultät für Naturwissenschaften, Südböhmische Universität, České Budějovice, 37005, Tschechische Republik

Marie Vancová, Eva Ďurinová und Tomáš Bílý

Institut für wissenschaftliche Instrumente CAS, Brünn, 612 000, Tschechische Republik

Radim Skoupý und Vladislav Krzyžánek

Fakultät für Naturwissenschaften, Karls-Universität in Prag, Prag, 128 00, Tschechische Republik

Jana Nebesářová

CRYTUR, Spol. S RO, Turnov, 511 01, Tschechische Republik

Aleš Kolouch & Petr Horodyský

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MV entwarf das Experiment, schrieb das Manuskript, bereitete die Proben vor und führte die Kathodolumineszenz-REM-Bildgebung durch. RS beteiligte sich an der Kathodolumineszenz-REM-Bildgebung und führte eine Simulation der CL-Auflösung durch. ED führte die Kultivierung und In-vivo-Bildgebung durch. TB führte eine Bildanalyse durch. Das Manuskript wurde unter Mitwirkung aller Autoren verfasst. Alle Autoren haben der endgültigen Fassung des Manuskripts zugestimmt.

Korrespondenz mit Marie Vancová.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Vancová, M., Skoupý, R., Ďurinová, E. et al. Kathodolumineszenzbildgebung von Zellstrukturen, die mit lumineszierenden Iridium- oder Rheniumkomplexen markiert sind, bei kryogenen Temperaturen. Sci Rep 12, 13432 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17723-w

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Eingegangen: 09. März 2022

Angenommen: 29. Juli 2022

Veröffentlicht: 04. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17723-w

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