Eliminierung von Methicillin

Military Medical Research Band 10, Artikelnummer: 21 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Behandlung von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA)-Biofilminfektionen bei der Implantatinsertion wird durch die fehlende antimikrobielle Aktivität von Titanimplantaten (Ti) eingeschränkt. Es besteht Bedarf an der Erforschung wirksamerer Ansätze zur Behandlung von MRSA-Biofilminfektionen.

Hierin wird eine Grenzflächenfunktionalisierungsstrategie durch die Integration von mesoporösen Polydopamin-Nanopartikeln (PDA), Stickstoffmonoxid (NO) freisetzendem Donor Natriumnitroprussid (SNP) und osteogenem Wachstumspeptid (OGP) auf Ti-Implantaten vorgeschlagen, bezeichnet als Ti-PDA@SNP- OGP. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften von Ti-PDA@SNP-OGP wurden durch Rasterelektronenmikroskopie, Röntgenphotoelektronenspektroskop, Wasserkontaktwinkel, photothermische Eigenschaften und NO-Freisetzungsverhalten bewertet. Die synergistische antibakterielle Wirkung und die Eliminierung der MRSA-Biofilme wurden durch 2′,7′-Dichlorfluoresceindiacetat-Sonde, 1-N-Phenylnaphthylamin-Assay, Adenosintriphosphat-Intensität, o-Nitrophenyl-β-d-galactopyranosid-Hydrolyseaktivität und Bicinchoninsäure-Austritt bewertet. Fluoreszenzfärbung, Tests auf alkalische Phosphataseaktivität, Kollagensekretion und extrazelluläre Matrixmineralisierung, quantitative Echtzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion und Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) wurden verwendet, um die Entzündungsreaktion und osteogene Fähigkeit im Knochenmarkstroma zu bewerten Zellen (MSCs), RAW264.7-Zellen und ihr Co-Kultursystem. Giemsa-Färbung, ELISA, Mikro-CT, Hämatoxylin und Eosin, Masson-Trichrom und immunhistochemische Färbung wurden verwendet, um die Beseitigung von MRSA-Biofilmen, die Hemmung der Entzündungsreaktion und die Förderung der Osseointegration von Ti-PDA@SNP-OGP in vivo zu bewerten.

Ti-PDA@SNP-OGP zeigte eine synergistische photothermische und NO-abhängige antibakterielle Wirkung gegen MRSA nach Bestrahlung mit Licht im nahen Infrarot und beseitigte effektiv die gebildeten MRSA-Biofilme durch die Induktion von durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) vermittelten oxidativen Stress, der die Integrität der Bakterienmembran zerstörte und verursacht ein Austreten intrazellulärer Komponenten (P < 0,01). In-vitro-Experimente zeigten, dass Ti-PDA@SNP-OGP nicht nur die osteogene Differenzierung von MSCs erleichterte, sondern auch die Polarisierung von proinflammatorischen M1-Makrophagen zum antiinflammatorischen M2-Phänotyp förderte (P < 0,05 oder P < 0,01). Die günstige osteoimmune Mikroumgebung erleichterte darüber hinaus die Osteogenese von MSCs und die Entzündungshemmung von RAW264.7-Zellen über mehrere parakrine Signalwege (P < 0,01). Die In-vivo-Bewertung bestätigte die oben genannten Ergebnisse und ergab, dass Ti-PDA@SNP-OGP eine bessere Osseointegration in einem MRSA-infizierten femoralen Defektimplantationsmodell induzierte (P < 0,01).

Diese Ergebnisse legen nahe, dass Ti-PDA@SNP-OGP ein vielversprechendes multifunktionales Material für die hocheffiziente Behandlung von MRSA-Infektionen bei Implantatersatzoperationen ist.

Biomaterial-assoziierte Infektionen (BAI) sind eine globale Gesundheitsbelastung, die für etwa 40 % aller im Krankenhaus erworbenen Infektionen in den USA verantwortlich ist [1]. Während der gesamten Lebensdauer von Implantaten, aber nicht nur während des Implantationsprozesses, kommt es zu Infektionen, die unweigerlich zum Versagen von Titan (Ti)-Implantaten führen [2, 3]. Die Bildung von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA)-Biofilmen auf den Oberflächen von Ti-Implantaten verschärft die Belastung durch BAI [4]. Die extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) werden in der von MRSA abgesonderten Matrix präsentiert, die die intramembranösen Bakterien vor dem Immunsystem des Wirts und äußeren Umwelteinflüssen wie dem Eindringen von Antibiotika und Umweltdruck schützen kann [5, 6]. Bei der Behandlung implantatassoziierter MRSA-Infektionen ist die Entfernung und der Austausch der infizierten Implantate häufig die Wahl von Hobson, da herkömmliche Antibiotika bei der Beseitigung von MRSA-Biofilmen unwirksam sind [7, 8]. Die nicht optimale postoperative Osseointegrationsfähigkeit von Ti-Implantaten verringert ihre Wirksamkeit zusätzlich [9]. Daher besteht Bedarf an der Entwicklung einer neuartigen Strategie, die gleichzeitig die MRSA-Biofilme beseitigt und die Osseointegration von Ti-Implantaten verbessert, ohne eine Arzneimittelresistenz hervorzurufen.

Die photothermische Therapie (PTT) ist ein nichtinvasiver Ansatz, der umfassend zur Beseitigung von Biofilmen erforscht wurde. Dieser Ansatz zeichnet sich durch tiefe Gewebepenetration, Anwendungsanpassungsfähigkeit, hohe Selektivität, geringe Risiken für Arzneimittelresistenzen und minimale Nebenwirkungen aus [10,11,12]. Zu den häufig verwendeten photothermischen Wirkstoffen gehören Metallnanopartikel (z. B. Gold- und Kupfernanopartikel), organische Moleküle (z. B. Porphyrin, Indocyaningrün, Thiadiazol-Derivate), Materialien auf Kohlenstoffbasis (z. B. Graphenoxid, Kohlenstoffnanoröhren, Kohlenstoffnitrid) und Metallsulfide ( z. B. Kupfersulfid, Kupfersulfid, Molybdändisulfid) [13,14,15,16,17]. Polydopamin-Nanopartikel (PDA) sind aufgrund ihrer hohen Fähigkeit zur photothermischen Umwandlung, ihrer hervorragenden Biokompatibilität und ihrer Machbarkeit zur Modifikation vielversprechende photothermische Wirkstoffe [18,19,20]. In einer früheren Studie wurde berichtet, dass zusammengesetzte Hydrogele, die aus mit Laurinsäure gepfropftem Chitosan, Dibenzaldehyd-modifiziertem Polyethylenglykol und Curcumin-beladenen PDA-Nanopartikeln bestehen, eine starke antibakterielle Wirkung gegen Wundinfektionen aufweisen. Diese Aktivität wurde auf den synergistischen Effekt zwischen durch Nahinfrarotlicht (NIR) ausgelöster, bedarfsgesteuerter Freisetzung von Curcumin und Hyperthermie zurückgeführt [21]. Die Biofilme wurden jedoch nur durch die Anwendung von NIR-Bestrahlung bei 70 °C beseitigt. Obwohl der menschliche Körper relativ hohe lokale Temperaturen für kurze Zeit aushalten kann, kann das umgebende normale Gewebe unter Hochtemperaturbedingungen geschädigt werden [22, 23]. Die durch PTT induzierte milde Temperatur (~ 5 °C) führt zu weniger nachteiligen Auswirkungen, aber die antibakteriellen und Anti-Biofilm-Aktivitäten sind bei dieser milden Temperatur deutlich reduziert [24, 25]. Um dieses Problem anzugehen, haben Wissenschaftler PTT mit der Anwendung antibakterieller Wirkstoffe kombiniert, um die Bildung von Biofilmen zu hemmen und etablierte Biofilme zu beseitigen.

Die Kombination von Gastherapie mit PTT ist ein vielversprechender Ansatz zur Verbesserung der Wirksamkeit von PTT gegen bakterielle Infektionen, infizierte Wunden, Entzündungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Krebs [26,27,28]. Die Behandlung bakterieller Infektionen durch Gastherapie beinhaltet die Verwendung einer großen Menge gasförmiger Moleküle wie Wasserstoff, Schwefelwasserstoff, Kohlenmonoxid, Kohlendioxid, Schwefeldioxid und Stickoxid (NO) [29,30,31,32,33, 34]. NO ist ein wichtiges endogenes Gasmolekül bei physiologischen und pathologischen Prozessen. Die antibakterielle Wirksamkeit von NO wird auf seine schädigende Wirkung auf Proteine ​​und DNA-Moleküle in hohen Konzentrationen zurückgeführt. NO besitzt eine starke antibakterielle Aktivität gegen die bakterielle Invasion bei Säugetieren, ohne eine Arzneimittelresistenz zu verursachen [35, 36]. Dennoch ist der Einsatz der Gastherapie zur Behandlung bakterieller Infektionen durch eine unzureichende Gasansammlung an der infizierten Stelle, ein unkontrolliertes Freisetzungsverhalten und ungenaue Therapiemechanismen begrenzt [37, 38]. Bisher wurden verschiedene NO-auslösende Ansätze untersucht. Zu diesen Ansätzen gehören Glutathion-, Enzym-, pH-, H2O2- und photothermische Behandlungen. Unter diesen ist PTT aufgrund seiner tiefen Gewebepenetration und des kontrollierbaren Freisetzungsverhaltens von NO unter NIR-Bestrahlung ein vielversprechender und effizienter Ansatz [23]. Folglich besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung NIR-laserstimulierter Arzneimittelabgabesysteme mit einem „on-demand“-Freisetzungsverhalten, um die Spezifität der Gastherapie zu verbessern.

Mit der Entwicklung der Nanotechnologie wurden Diazeniumdiolate (NONOate), N,N′-Disecbutyl-N,N′-dinitroso-p-phenylendiamin (BNN6), S-Nitrosoglutathion (GSNO) und L-Arginin (L-Arg) entwickelt werden häufig als NO-Spender eingesetzt [23, 28]. Probleme wie Nebenprodukttoxizität, kurze Halbwertszeit, unzureichende Gasansammlung, unkontrolliertes Freisetzungsverhalten und ungenaue therapeutische Mechanismen schwächen jedoch die therapeutische Wirksamkeit dieser Verbindungen in vivo [28]. Im Vergleich dazu ist Natriumnitroprussid (SNP) biokompatibel als andere und kann aufgrund seiner Empfindlichkeit gegenüber hohen Temperaturen als photothermisch ausgelöster Spender für die „bedarfsgesteuerte“ Freisetzung von NO verwendet werden [39, 40].

Um die Beseitigung von MRSA-Biofilmen und eine verbesserte Osseointegration zu erreichen, wurde in dieser Studie eine multifunktionale Strategie vorgeschlagen, bei der NO-Gastherapie, PTT mit Peptid-Arzneimitteltherapie auf Ti-Implantaten gekoppelt wurden.

Ti-Stäbe (Länge: 10 mm, Durchmesser: 15 mm) und Ti-Folien (10 mm × 10 mm, 0,25 mm dick) wurden vom Northwest Institute for Non-ferrous Metal Research (Xi'an, China) bezogen. Dopaminhydrochlorid, Fluoresceindiacetat, Propidiumiodid, Pluronic F-127, DCFH-DA, o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG) und Hoechst 33258 wurden von MilliporeSigma (St. Louis, MO, USA) bezogen. SNP, Tris(hydroxymethyl)animomethan (Tris), 1,3,5-Trimethylbenzol, Polymyxin B und N-Phenyl-1-naphthylamin wurden von Aladdin Industrial Co. Ltd. (Shanghai, China) gekauft. Zellzählkit-8 (CCK-8), Mueller-Hinton-Brühe (MHB), Agarose und Paraformaldehyd wurden von Solarbio Biotechnology Co. (Peking, China) bezogen. Bicinchoninsäure (BCA)-Testkit, Griess-Reagenz, Laktatdehydrogenase (LDH)-Testkit, BCIP/NBT-Färbekit für alkalische Phosphatase (ALP), ALP-Testkit, Siriusrot-Färbekit, Alizarinrot-Natriumsalz, verstärktes Adenosintriphosphat (ATP) Assay-Kit, 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)-Nachweiskit, Hämatoxylin- und Eosin (HE)-Färbekit, Massons Trichrom-Färbekit und Giemsa-Färbekit wurden von Beyotime Biotechnology Co. (Jiangsu, China) erworben. Osteogenes Wachstumspeptid (OGP, ALKRQGRTLYGFGG) wurde von Top-Peptide Co., Ltd. (Shanghai, China) gekauft. Rhodamin-Phalloidin, Trizol-Reagenz und Primer wurden von Invitrogen Co. (CA, USA) bezogen. ELISA-Kits (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) für Runt-bezogenen Transkriptionsfaktor 2 (Runx2), knochenmorphogenetisches Protein 2 (BMP2), vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF-β) und Tumor Nekrosefaktor-α (TNF-α), Interleukin-6 (IL-6) und IL-10 wurden von ABclonal Biotechnology bezogen. Co., Ltd. (Wuhan, China). Andere Chemikalien wurden von Xingguang Chemical Co. (Chongqing, China) gekauft.

Pluronic F-127 (0,36 g) und 1,3,5-Trimethylbenzol (0,36 g) wurden gemischt und in einer Mischung aus H2O (65 ml) und Ethanol (60 ml) gelöst. Tris (90 mg) und Dopaminhydrochlorid (60 mg) wurden zugegeben und 24 Stunden lang im Dunkeln gerührt. Die Matrize und das PDA wurden durch Zentrifugation entfernt. Das PDA wurde dreimal mit der Mischung aus Ethanol und Aceton gewaschen. Die synthetisierten PDA-Nanopartikel wurden in Ethanol dispergiert und zur anschließenden Analyse bei -20 °C gelagert.

PDA@SNP-Nanopartikel wurden durch Dispergieren von PDA-Nanopartikeln (5 mg) in Ethanol hergestellt. Unter Rühren wurde eine vorbereitete SNP-Lösung (2,5 mg/ml) eingebracht. Die schwarze Mischung wurde durch Zentrifugation (11.000 U/min, 10 min) nach 24 Stunden gesammelt und die PDA@SNP-Nanopartikel wurden mit entionisiertem Wasser gespült.

Die PDA@SNP-Nanopartikel wurden in Tris-HCl-Puffer (10 mmol/l, pH 8,5) eingetaucht, der OGP (2 mg/ml) enthielt, um eine kovalente Immobilisierung von OGPs sicherzustellen. Nachdem die Mischung 24 Stunden lang gerührt wurde, wurden die PDA@SNP-OGP-Nanopartikel gesammelt und mit entionisiertem Wasser gespült. Die Morphologie von PDA, PDA@SNP und PDA@SNP-OGP wurde mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, Talos F200S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) analysiert. Die Gesamtmenge an an den PDA@SNP-Nanopartikeln konjugiertem OGP wurde mit einem Ultraviolett-Vis-Spektrophotometer (UV-3600, Shimadzu, Japan) bestimmt.

Saubere Ti-Folien wurden in Dopaminhydrochloridlösung (2 mg/ml), die 10 mmol/L Tris-Puffer (20 ml, pH 8,5) enthielt, eingeweicht und 24 Stunden lang inkubiert. Anschließend wurden PDA-, PDA@SNP- oder PDA@SNP-OGP-Nanopartikel (0,3 mg) durch die Dopaminbeschichtung auf dem Ti-Substrat immobilisiert. Die Proben wurden mit entionisiertem Wasser gespült und als Ti-PDA, Ti-PDA@SNP oder Ti-PDA@SNP-OGP bezeichnet. Die Morphologie, Oberflächenchemie und Wasserkontaktwinkel (WCA) dieser Substrate wurden durch Rasterelektronenmikroskopie (REM, Quattro S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) und Röntgenphotoelektronenspektroskop (XPS, Empyrean, Niederlande) analysiert. bzw. Kontaktwinkelgoniometrie (SDC-200S, Sindin, China). Das Querschnittsbild und die Dicke der PDA@SNP-OGP-Beschichtung auf dem Ti-Implantat wurden mittels REM beobachtet. Die Haftfestigkeit der Beschichtung wurde mit einem Kratztester (CSM Instruments, Schweiz) untersucht.

Der photothermische Effekt der vorbereiteten Nanopartikel wurde unter Verwendung von NIR-Strahlung bewertet, die von einem 808-nm-Laser (Mild-River Company, China) emittiert wurde. Temperaturänderungen in Echtzeit wurden mit einem digitalen Thermometer (HH806AU, Omega Engineering, Norwalk, CT, USA) aufgezeichnet. Kurz gesagt wurden PDA-, PDA@SNP- und PDA@SNP-OGP-Nanopartikel (0,5 mg/ml) 10 Minuten lang einem 808-nm-Laser (1,00 W/cm2) ausgesetzt. Die photothermische Umwandlungseffizienz (η) sowie die Heiz- und Kühlkurven von PDA-, PDA@SNP- und PDA@SNP-OGP-Nanopartikeln (0,5 mg/ml) wurden gemäß den folgenden Gleichungen bewertet:

Dabei ist Tmax die durch die Proben (PDA-, PDA@SNP- oder PDA@SNP-OGP-Nanopartikel) induzierte maximale Temperatur, Tmax,water die maximale Wassertemperatur und Tsurr die Raumtemperatur. Q0 ist der Hintergrundenergieeintrag ohne Proben und wird aus Gl. berechnet. (3). I ist die Laserleistung (1 W/cm2), A808 ist die Absorption der Probe (PDA, PDA@SNP und PDA@SNP-OGP-Nanopartikel) bei 808 nm, h ist der Wärmeübertragungskoeffizient, S ist die Oberfläche des Probenbehälters , md ist das Gewicht der PDA-, PDA@SNP- oder PDA@SNP-OGP-Nanopartikellösung und cd ist die Wärmekapazität von Wasser.

Der photothermische Effekt von nativem Ti oder funktionalisiertem Ti-Substrat wurde mit einem Infrarot-Wärmebildsystem (E40 IR-Bildsystem, FLIR, Wilsonville, OR, USA) bewertet. Ti wurde in phosphatgepuffertem Salzlösungspuffer (PBS) (500 μl) eingeweicht und einer NIR-Bestrahlung (1,00 W/cm2, 10 min) ausgesetzt. Die Temperaturänderungen jeder Probe wurden aufgezeichnet und das Zeitintervall auf 30 s eingestellt. Darüber hinaus wurden Temperaturänderungen des mit unterschiedlichen NIR-Leistungsdichten (0,25, 0,50, 1,00 und 1,25 W/cm2) bestrahlten Ti-PDA@SNP-OGP ausgewertet.

Zur Bestimmung des NO-Gehalts wurde Griess-Reagenz verwendet. Ti-PDA@SNP-OGP wurde 10 Minuten lang NIR (1,00 W/cm2) ausgesetzt, gefolgt von 20 Minuten ohne NIR-Bestrahlung, und dieser Vorgang wurde fünfmal wiederholt. Das resultierende Medium wurde mit Griess-Reagenz (50 µl) behandelt. Die Menge an aus Ti-PDA@SNP-OGP freigesetztem NO wurde bei 548 nm mit einem UV-Vis-Spektrophotometer bestimmt. Die kumulativen Freisetzungsprofile von NO aus Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP und Ti-PDA@SNP-OGP wurden ebenfalls bewertet. Die Konzentration des freigesetzten NO wurde anhand einer Standardkurve berechnet.

MRSA (ATCC33591) wurde zur Bewertung der Anti-Biofilm-Eigenschaft verwendet. Die Proben wurden mit 1 ml MRSA-Suspension [1 × 108 koloniebildende Einheiten (KBE)/ml] in der stationären Wachstumsphase bei 37 °C für 3 Tage kultiviert, und das MHB-Kulturmedium wurde jeden Tag ersetzt. Die Anti-Biofilm-Eigenschaft und der Anti-Biofilm-Mechanismus wurden mithilfe des Plattentests, der SEM-Untersuchung, der Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), der Membranpermeabilität, der ATP-Intensität und der ONPG-Hydrolyse mit oder ohne NIR-Bestrahlung bestimmt.

Für die Anti-Biofilm-Aktivität wurden die Proben mit 1 ml MRSA-Suspension (1 × 108 KBE/ml) in der stationären Wachstumsphase kultiviert und 3 Tage bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Proben 10 Minuten lang einer NIR-Bestrahlung (1,00 W/cm2) ausgesetzt. Nicht anhaftende Bakterien wurden durch vorsichtiges Waschen mit PBS entfernt. In jede Vertiefung wurde ein Milliliter steriles PBS gegeben und das behandelte MRSA durch 10-minütige Ultraschallbehandlung von den Substraten entfernt. Die Bakteriensuspension wurde mit sterilem PBS 10.000-fach verdünnt. Anschließend wurden 100 μl verdünnte Bakteriensuspension auf die Agarplatten verteilt. Die KBE wurden abgebildet und gezählt. Das antibakterielle Verhältnis jedes Substrats wurde anhand der Formel berechnet: A = (B – C)/B × 100 %; Dabei ist A das antibakterielle Verhältnis, B die durchschnittliche KBE der Kontrollgruppe (Ti) und C die durchschnittliche KBE der Versuchsgruppe.

Der MRSA-Biofilm wurde auf Ti- oder funktionalisiertem Ti-Substrat mit oder ohne NIR-Bestrahlung 10 Minuten lang kultiviert. Die Biofilme wurden durch Ultraschall entfernt, um eine Bakteriensuspension zu erzeugen. Die Suspension wurde auf einen Siliziumwafer gegeben und über Nacht mit Paraformaldehyd (4 Gew.-%) bei 4 °C fixiert. Die Proben wurden mit einer aufsteigenden Ethanolreihe (25 %, 50 %, 75 % und 100 %) dehydriert und mit tert-Butanol 10 Minuten lang weiter dehydriert. Die getrockneten Proben wurden zur REM-Untersuchung durch Sputtern mit Gold beschichtet.

Die ROS-Erzeugung in den verschiedenen Gruppen wurde unter Verwendung der 2′,7′-Dichlorfluoresceindiacetat-Sonde (DCFH-DA) bewertet. Eine MRSA-Suspension (1 ml, 1 × 106 KBE/ml) wurde auf Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP oder Ti-PDA@SNP-OGP mit/ohne 808-nm-NIR-Laserbestrahlung kultiviert. Die Bakteriensuspension wurde 24 Stunden lang inkubiert und mit DCFH-DA-Lösung (10 μm) behandelt. Nach 30-minütiger Inkubation der Proben wurde die Fluoreszenzintensität mit einem Fluoreszenzspektrophotometer (RF5301PC, Shimadzu, Kyoto, Japan) mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 525 nm bestimmt.

Zur Untersuchung der Membranpermeabilität von MRSA wurde eine 1-N-Phenylnaphthylamin (NPN)-Fluoreszenzsondenmethode verwendet. Durch Zentrifugation (5000 U/min, 8 min) wurde eine MRSA-Suspension erhalten und 30 min mit der NPN-Fluoreszenzsonde (10 μl, 10 μmol/l) behandelt. Die Fluoreszenzintensität der Lösung wurde mit einem Fluoreszenzspektrophotometer (Anregungswellenlänge 350 nm, Emissionswellenlänge 420 nm) bestimmt. Als Positivkontrolle diente eine mit Polymyxin B behandelte MRSA-Suspension. Die Fluoreszenzintensitäten der Versuchsgruppen wurden auf die der Kontrollgruppe (Ti ohne NIR-Bestrahlung) normiert.

Der BCA-Assay wurde durchgeführt, um den Proteinaustritt von MRSA nach verschiedenen Behandlungen zu untersuchen. MRSA (1 ml, 1 × 106 KBE/ml) wurde über Ti, Ti-PDA, Ti-MPDA@SNP oder Ti-PDA@SNP-OGP ausgesät. Danach wurde das Kulturmedium gesammelt und 20 s lang gevortext. Dann wurde die Mischung (400 μl) entnommen und mit einem Spritzenfilter (0,22 μm) filtriert. Als nächstes wurde die Filtratprobe (25 μl) dem Standard-BCA-Protein-Assay-Kit hinzugefügt und bei 37 °C unter leichtem Schütteln (200 U/min) inkubiert. Zuletzt wurde die Absorption der erhaltenen Lösung bei 490 nm unter Verwendung eines spektrophotometrischen Mikroplattenlesegeräts (Bio-Rad 680, Hercules, CA, USA) bestimmt. Die Proteinverlustmenge = (die Proteinmenge in jeder Versuchsgruppe − die Proteinmenge in der Kontrollgruppe). Als Kontrollgruppe wurde LB-Medium mit Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP und Ti-PDA@SNP-OGP ohne Zusatz von MRSA verwendet, und LB-Medium mit Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP und Als Versuchsgruppen wurde Ti-PDA@SNP-OGP mit Zusatz von MRSA verwendet.

Ein ATP-Assay-Kit wurde verwendet, um die ATP-Intensität von MRSA unter verschiedenen Bedingungen zu bewerten. MRSA (1 ml, 1 × 106 KBE/ml) wurde über Ti, Ti-PDA, Ti-MPDA@SNP oder Ti-PDA@SNP-OGP ausgesät. Die Hälfte der Proben jeder Gruppe wurde einer NIR-Bestrahlung ausgesetzt, während die andere Hälfte nicht bestrahlt wurde. Die ATP-Intensitäten wurden mit einem Fluoreszenzspektrophotometer bei 562 nm ausgewertet. Die relative Fluoreszenzintensität der Versuchsgruppen wurde durch Normalisierung der Fluoreszenzintensität auf die von reinem Ti ohne NIR-Bestrahlung (Kontrollgruppe) ermittelt.

Eine ONPG-Hydrolyse wurde durchgeführt, um die Membranpermeabilität der in den MRSA-Biofilmen vorhandenen Bakterien zu bewerten. Die MRSA-Biofilme wurden 10 Minuten lang mit/ohne 808 NIR-Bestrahlung behandelt. Die auf den verschiedenen Substraten gewachsenen Biofilme wurden durch Ultraschallbehandlung (10 min) geerntet und mit ONPG-Lösung (500 μl, 0,75 mol/l) inkubiert. Die optischen Dichtewerte der Überstände wurden bei 405 nm unter Verwendung eines spektrophotometrischen Mikroplattenlesegeräts (Bio-Rad 680, Hercules, CA, USA) bestimmt.

Für die Dehydrogenaseaktivität der Atmungskette wurde MRSA (1 ml, 1 × 106 KBE/ml) mit Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP und Ti-PDA@SNP-OGP mit/ohne Laserbestrahlung bei 37 °C inkubiert C für 12 Stunden. Anschließend werden das Kulturmedium (250 μl), Glucoselösung (1 ml, 100 mmol/L), Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS)-Puffer (1 ml, 50 mmol/l, pH = 8,6), 4 % 2, 3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Lösung und LB-Brühe (250 μl) wurden in ein Röhrchen gegeben. Nach 6-stündiger Inkubation wurde der obigen Mischung konzentrierte Schwefelsäure (50 μl) zugesetzt, um die Reaktion zu stoppen. Anschließend wurde das gebildete enzymatische Reaktionsprodukt [1,3,5-Triphenylformazan (TPF)] mit Toluol extrahiert. Zuletzt wurde die Absorption der erhaltenen Lösung bei 490 nm unter Verwendung eines spektrophotometrischen Mikroplattenlesegeräts (Bio-Rad 680, Hercules, CA, USA) bestimmt. Die relative Aktivität der Atmungskettendehydrogenase (%) wurde nach der folgenden Formel berechnet: A = B/C × 100 %. Wobei A die relative Aktivität der Atmungskettendehydrogenase angibt; B ist der durchschnittliche OD490-Wert der Kontrolle (Ti ohne NIR-Bestrahlung); und C ist der durchschnittliche OD490-Wert experimenteller Proben.

Der Austritt intrazellulärer Komponenten als Indikator für die Bewertung der Membranintegrität in Bakterien wurde mit dem OD260-Ansatz gemessen. 1 ml MRSA (5 × 108 KBE/ml) wurde mit Ti-, Ti-PDA-, Ti-PDA@SNP- und Ti-PDA@SNP-OGP-Substraten kultiviert. Die Hälfte der Proben jeder Gruppe wurde einer NIR-Bestrahlung ausgesetzt, während die andere Hälfte nicht bestrahlt wurde. Anschließend wurde die Mischung mit einem Spritzenfilter (0,22 μm) filtriert, um Bakterien und andere Materialien zu entfernen. Abschließend wurde die Absorption der erhaltenen Lösung bei 260 nm mit einem UV-Vis-Spektrophotometer (UV-3600, Shimadzu, Japan) bestimmt.

Wie bereits berichtet, wurden Knochenmarkstromazellen (MSCs) aus den Schienbeinen und dem Oberschenkelknochen von zehn Sprague-Dawley-Ratten (SD) (männlich, 100–120 g) isoliert [41, 42, 43]. Die SD-Ratten wurden von der Chongqing Medical University zur Verfügung gestellt und die Nummer der Produktionslizenz für Versuchstiere war SCXK 2022-0010. Das Medium wurde alle 2 Tage gewechselt und in den nachfolgenden Experimenten wurden MSCs aus der dritten Passage verwendet. RAW264.7-Zellen (Army Medical University, Chongqing, China) wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mit hohem Glucosegehalt, ergänzt mit Streptomycin/Penicillin, und 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (Hyclone, USA) unter 5 % kultiviert. CO2 bei 37 °C.

Knochen-MSCs (1 × 104 Zellen/Vertiefung) oder RAW264.7-Zellen (1 × 104 Zellen/Vertiefung) wurden mit verschiedenen Substraten für 2 Tage inkubiert [20]. Die Zellen wurden dann 5 Minuten lang mit Triton X-100 (0,2 %) lysiert und über Nacht mit einer Rhodamin-Phalloidin-Lösung zur Färbung des Zytoskeletts behandelt. Nach dem Färben wurden die Proben mit PBS gespült und die MSCs oder RAW264.7-Zellkerne wurden mit Hoechst 33258 (200 μl) gefärbt.

Morphologische Veränderungen in MSCs oder RAW264.7-Zellen wurden mithilfe einer konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM; FV3000, Olympus, Tokio, Japan) bewertet.

Nach einer Inkubationszeit von 1, 4 oder 7 Tagen wurde den Vertiefungen jeder Gruppe eine Mischung aus CCK-8-Lösung und Kulturmedium (1:9, v/v) zugesetzt. Die optischen Dichtewerte der Überstände wurden nach 2-stündiger Inkubation mit einem spektrophotometrischen Mikroplattenlesegerät bei 450 nm bestimmt. RAW264.7-Zellen wurden 1, 3 und 5 Tage lang auf verschiedenen Substraten kultiviert. Der CCK-8-Assay wurde durchgeführt, um die Zellproliferation zu bewerten.

Zellen, die 7 Tage lang auf verschiedenen Substraten kultiviert wurden, wurden mit einem ALP-Kit analysiert. Auf verschiedenen Substraten kultivierte Knochen-MSCs wurden 2 Stunden lang mit Sirius-Rot-Lösung gefärbt. Die gefärbten Zellen wurden mit NaOH behandelt, um die roten Kristalle aufzulösen. Die optischen Dichtewerte der Überstände wurden bei 540 nm mit einem spektrophotometrischen Mikroplattenlesegerät gemessen.

Zusätzliche MSCs wurden 21 Tage lang inkubiert und mit Alizarinrot (0,1 %) gefärbt, um den Mineralisierungsgrad der extrazellulären Matrix (ECM) zu bewerten.

Die gefärbten Mineralknötchen wurden mit CH3COOH-Lösung (10 %) aufgelöst und die optischen Dichtewerte der Überstände wurden bei 405 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät bestimmt.

RAW264.7-Zellen (5 × 104 Zellen/ml) wurden durch Zugabe von Lipopolysaccharid (LPS)-Lösung (40 ng/ml) zum Medium aktiviert, um die Polarisation von Makrophagen in den M1-Typ zu stimulieren, gefolgt von einer gemeinsamen Inkubation mit verschiedenen Substraten. Nach 24-stündiger Kultivierung wurde die entzündungshemmende Aktivität anhand der Expressionsniveaus repräsentativer Gene vom M1-Typ [CD86, induzierbare Stickoxidsynthase (iNOS) und CD11C], M2-Typ [CD206, Arginase-1 (Arg.)] bewertet -1) und CD163], proinflammatorische Zytokine (TNF-α und IL-1β) und entzündungshemmende Zytokine (IL-10 und IL-1ra).

Knochen-MSCs oder RAW264.7-Zellen wurden in 24-Well-Platten mit verschiedenen Substraten kultiviert. Die Gesamt-RNA wurde aus MSCs oder RAW264.7-Zellen mit dem Total RNA Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) extrahiert. Die RNA wurde unter Verwendung eines Reverse-Transkriptions-Kits (Takara, Shiga, Japan) revers in komplementäre DNA transkribiert. Für die qRT-PCR wurde ein Bio-Rad CFX Manager-System verwendet. Die verwendeten Primer sind in der Zusatzdatei 1: Tabelle S1 aufgeführt. Die relativen Genexpressionsniveaus wurden durch Normalisierung der Expressionsniveaus auf das Niveau des Haushaltsgens β-Actin ermittelt.

Die Konzentrationen von TNF-α, IL-1β, IL-10 und IL-6, die von auf verschiedenen Substraten ausgesäten RAW264.7-Zellen sezerniert werden, wurden mithilfe von ELISA-Kits bestimmt. RAW264.7-Zellen (5 × 104 Zellen/ml) wurden auf verschiedenen Substraten kultiviert und 3 Tage lang inkubiert. Die Proben wurden zentrifugiert, die Überstände gesammelt und die Zytokinkonzentrationen anhand von Standardkurven bestimmt.

Ein Transwell-Co-Kulturexperiment wurde durchgeführt, um die osteogene Differenzierung von MSCs unter dem Einfluss von RAW264.7-Zellen zu bewerten. Knochen-MSCs (1 × 104 Zellen/Vertiefung) wurden in der oberen Transwell-Kammer (Corning, New York, USA; Porengröße: 8 μm, Innendurchmesser: 6,5 mm) ausgesät und 24 Stunden lang mit RAW264.7-Zellen co-kultiviert [41]. Die MSCs, die durch die Membran wanderten, wurden mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und mit 1 % Kristallviolettreagenz angefärbt. Die gefärbten MSCs wurden unter Verwendung eines Umkehrmikroskops (Zeiss, Jena, Deutschland) analysiert.

RAW264.7-Zellen (1 × 104 Zellen/Well) wurden 2 Tage lang auf Ti oder funktionalisiertem Ti-Substrat kultiviert. Das probenkonditionierte Medium wurde gesammelt und zentrifugiert (1000 U/min, 4 min), um restliche Zellen zu entfernen. Die MSCs wurden dann auf Platten mit 24 Vertiefungen unter Zugabe des konditionierten Mediums (1 ml) aus jeder Gruppe kultiviert. Das probenkonditionierte Medium wurde alle 2 Tage gewechselt. Die Zellen wurden zu einem vorgegebenen Zeitpunkt mit 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP)/Nitroblautetrazolium (NBT), Siriusrot und Alizarinrot S-Färbereagenzien behandelt. Die mRNA-Expressionsniveaus osteogenesebezogener Gene (Runx2, BMP2, ALP, OPN und OCN) wurden bewertet.

Alle In-vivo-Tierversuche wurden gemäß den institutionellen Richtlinien und relevanten Vorschriften für Tierversuche mit Labortieren der Medizinischen Universität Chongqing und des Siebten Medizinischen Zentrums des PLA General Hospital durchgeführt und von den Tierethikkommissionen der Medizinischen Universität Chongqing genehmigt (2021-2021). 738) und das Siebte Medizinische Zentrum des PLA General Hospital (2021-110). Vierzig SD-Ratten (männlich, 200–250 g) wurden von der Medizinischen Universität Chongqing bereitgestellt und für Implantationsoperationen verwendet. Die Ratten wurden betäubt und der Operationsbereich wurde rasiert und desinfiziert. Ein MRSA-infiziertes Femurdefektmodell wurde erfolgreich konstruiert, indem mit einem chirurgischen Bohrer ein zylindrischer Defekt (1,5 mm Durchmesser) in der Mitte des Femurkondylus in Richtung der Markhöhle hergestellt wurde. Die Operationsstellen wurden vernäht, nachdem die vorbereiteten Ti-Implantate mit gebildeten MRSA-Biofilmen vorsichtig in die Knochendefekte eingeführt wurden. Die Implantationsstelle wurde 10 Minuten lang einer NIR-Bestrahlung (1,00 W/cm2) ausgesetzt und Temperaturänderungen in Echtzeit wurden mit einer Wärmekamera aufgezeichnet.

Drei Tage nach der Implantation wurden Ratten getötet, um Femurproben zu sammeln, und die eingebetteten Implantate wurden vorsichtig entfernt. Die Implantate wurden in MHB getränkt und beschallt, um das anhaftende MRSA zu entfernen. Die Bakteriensuspension wurde 12 Stunden lang kultiviert, verdünnt (10.000-fach) und auf MHB-Agarplatten beimpft. Die Anti-Biofilm-Wirksamkeit jeder Probe wurde untersucht. Die Bakterienkolonien auf den Platten wurden nach 24-stündiger Kultivierung bei 37 °C ausgewertet und fotografiert. Die Implantate wurden in MHB-Medium eingeweicht und 14 Stunden lang kultiviert. Die Trübung jeder Gruppe wurde fotografiert und der Trübungsgrad bestimmt. In der Zwischenzeit wurde ein ELISA durchgeführt, um die TNF-α-, IL-6-, TGF-β- und IL-10-Konzentrationen zu bestimmen. Darüber hinaus wurden HE- und immunhistochemische (IHC)-Färbungen mit Anti-CD68- und Anti-CD206-Antikörpern durchgeführt, um die osteoimmunmodulatorische Wirkung zu untersuchen [42]. Knochengewebeschnitte wurden entwachst, in einer absteigenden Reihe von Ethanol (100–50 %) hydratisiert, das Antigen entnommen, 30 Minuten lang blockiert und über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern (CD86 und CD206) inkubiert. Die Schnitte wurden dann 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit den entsprechenden Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörpern behandelt, dann mit einem DAB-Nachweiskit zur Farbreaktion gefärbt und mit Hämatoxylin gegengefärbt.

Die Ratten wurden 30 Tage nach der Implantation getötet, um das Ausmaß der Osseointegration zwischen den Implantaten und dem ursprünglichen Knochengewebe zu untersuchen. Die Analysen wurden mittels Mikrocomputertomographie (Mikro-CT; Viva CT40, SCANCO Medical AG, Brüttisellen, Schweiz), HE und Masson-Trichrom-Färbung durchgeführt. Für die Mikro-CT wurden die entnommenen Oberschenkelknochen mit Formalinreagenz fixiert und 2 Tage lang inkubiert. Die behandelten Femuren wurden mit Mikro-CT gescannt und wie zuvor beschrieben analysiert [42]. Für die HE- und Masson-Trichrom-Färbung wurden die Implantate vorsichtig aus den Femuren entfernt und gefärbt. Die gefärbten Proben wurden unter Verwendung eines Umkehrmikroskops (Zeiss) beobachtet. Die biologische Sicherheit wurde auch mithilfe einer biochemischen Vollblutanalyse bewertet.

Alle Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Die Daten wurden in der Origin-Software (Version 8.0) mit dem Tukey-Test mittels einseitiger Varianzanalyse (ANOVA) zur statistischen Analyse verarbeitet. Die statistische Signifikanz wurde auf α = 0,05 voreingestellt.

Wie in Abb. 1a gezeigt, zeigte PDA eine gut verteilte sphärische Morphologie mit einem durchschnittlichen Durchmesser von (176 ± 12) nm. Die durchschnittlichen Durchmesser von PDA@SNP und PDA@SNP-OGP wurden nach dem Laden der SNP- bzw. OGP-Modifikation leicht auf (183 ± 18) nm und (196 ± 21) nm erhöht. Die TEM-Elementarkartierung zeigte, dass Eisen (Fe) in PDA@SNP-OGP gleichmäßig verteilt war (Abb. 1b). Differenzielle Lichtstreuung zeigte, dass die Größe von PDA@SNP-OGP relativ größer war als die Größe von PDA und PDA@SNP (Zusatzdatei 1: Abb. S1a), was mit TEM-Bildern übereinstimmt. Den Ergebnissen der Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR) zufolge wurden die Absorptionsbanden bei 1125 und 840 cm−1 υ-NH und υ-Ar des Benzolrings zugeschrieben. Absorptionspeaks von PDA@SNP bei 2102 und 1885 cm−1 entsprachen υ-CN (axiale und äquatoriale CN-Liganden) und υ-NO, was darauf hinweist, dass SNP erfolgreich auf PDA geladen wurde. Die υ-CN- und υ-NO-Banden von SNP sowie die υ-NH2- und υ-CONH-Banden von OGP wurden nach Modifikation mit OGP beobachtet (Zusatzdatei 1: Abb. S1b). Basierend auf der vorbereiteten Standardkurve [40] betrug die SNP-Beladungsrate von PDA@SNP 8,92 % – unter Verwendung der UV-Vis-Lichtspektroskopiespektren (Zusatzdatei 1: Abb. S1c).

Charakterisierung von Ti-PDA@SNP-OGP. a Transmissionselektronenmikroskopische (TEM) Bilder von PDA-, PDA@SNP- oder PDA@SNP-OGP-Nanopartikeln. Maßstabsbalken = 100 nm. b Elementkartierungen von PDA- und PDA@SNP-OGP-Nanopartikeln. Maßstabsbalken = 100 nm. c Rasterelektronenmikroskopische (REM) Bilder von Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP oder Ti-PDA@SNP-OGP. Maßstabsbalken = 1 μm. d Wasserkontaktwinkel (WCA) von Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP und Ti-PDA@SNP-OGP. e Heizkurven von Ti-PDA@SNP-OGP unter Verwendung von NIR-Bestrahlung mit unterschiedlichen Leistungsintensitäten. f Heizkurven von Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP oder Ti-PDA@SNP-OGP mit NIR-Bestrahlung (808 nm, 1,00 W/cm2). g Die kumulativen Konzentrationen von NO aus Ti-PDA@SNP oder Ti-PDA@SNP-OGP mit oder ohne NIR-Bestrahlung (808 nm, 1,00 W/cm2) für 10 Minuten. **P < 0,01; Titan, PDA-Polydopamin-Nanopartikel, SNP-Natriumnitroprussid, osteogenes Wachstumspeptid OGP, KEIN Stickoxid, NIR-Nahinfrarotlicht

Mithilfe von SEM wurden die Morphologien von Ti oder funktionalisiertem Ti-Substrat untersucht. Ti hatte eine relativ glatte Oberfläche (Abb. 1c). PDA, PDA@SNP und PDA@SNP-OGP waren gleichmäßig auf Ti verteilt, ohne offensichtliche Unterschiede in der Morphologie. Elementkartierungen der Verteilung von Ti, O, C, N und Fe in Ti-PDA@SNP-OGP. Die XPS-Analyse von Ti identifizierte Signale von Ti (88,92 %) und O (11,08 %). Für Ti-PDA@SNP-OGP wurden drei neue Peaks (C, N und Fe) identifiziert (Zusatzdatei 1: Abb. S1d). Die C 1 s-Spektren von Ti-PDA@SNP-OGP zeigten, dass die Hauptpeaks an den folgenden Orten konzentriert waren: C=O (287,7 eV), C-O (286,3 eV), C-N (285,4 eV), C −C (284,6 eV) und C=C (284,1 eV). Zwei O 1 s-Peaks bei 532,9 und 531,0 eV wurden O−C und O=C zugeschrieben. Im hochauflösenden N 1 s-Spektrum von Ti-PDA@SNP-OGP wurden vier Unterpeaks bei 399,8, 399,2, 398,9 und 398,2 eV –NH2, –N=O, –N=C, N− zugeordnet C bzw. (Zusatzdatei 1: Abb. S1e). Diese Ergebnisse sind ein Hinweis auf die von OGP vorgenommene Änderung an PDA@SNP-OGP. Ti war mit einem WCA von (60,0 ± 5,6)° hydrophober. Die WCA von Ti-PDA, Ti-PDA@SNP und Ti-PDA@SNP-OGP betrugen (35,0 ± 4,2)°, (32,4 ± 5,0)° bzw. (37,7 ± 4,8)° (Abb. 1d). Es wurde das Querschnitts-REM-Bild einer PDA@SNP-OGP-Beschichtung auf Ti gezeigt. Die Dicke der Beschichtung auf Ti lag zwischen 3,7 und 8,3 μm (Zusatzdatei 1: Abb. S2a). Die Haftfestigkeit von PDA@SNP-OGP-Beschichtungen auf Ti wurde mit einem Kratztester (CSM Instruments, Schweiz) gemessen. Die kritischen Belastungen (Lc1 und Lc2) von Ti-PDA@SNP-OGP betrugen etwa 1,14 bzw. 1,26 N (Zusatzdatei 1: Abb. S2b). Die Daten deuten auf eine gute mechanische Stabilität der PDA@SNP-OGP-Beschichtung nach dem Aufbringen auf Ti hin. Diese Beobachtung stimmte mit dem Ergebnis einer früheren Studie überein [4].

Das digitale photothermische NIR-Bildgebungssystem wurde verwendet, um den photothermischen Effekt von Ti-PDA@SNP-OGP bei verschiedenen NIR-Leistungsintensitäten zu bewerten. Die Temperatur von Ti-PDA@SNP-OGP betrug 35,6 °C bei 0,25 W/cm2, 41,3 °C bei 0,50 W/cm2, 52,3 °C bei 1,00 W/cm2 und 62,3 °C bei 1,25 W/cm2 nach der Bestrahlung 10 Minuten (Abb. 1e). Temperaturänderungen wurden für Ti oder funktionalisiertes Ti-Substrat unter Verwendung einer Bestrahlungsleistung (1,00 W/cm2) weiter bewertet. Die Temperatur von Ti stieg nach 10-minütiger Bestrahlung von 25,0 auf 33,7 °C. Allerdings stiegen die Temperaturen für Ti-PDA, Ti-PDA@SNP und Ti-PDA@SNP-OGP auf 52,8, 52,0 bzw. 52,1 °C (Abb. 1f). Die photothermische Umwandlungseffizienz (η) von Ti-PDA@SNP-OGP betrug nach Exposition gegenüber NIR-Bestrahlung 20,3 % (Zusatzdatei 1: Abb. S2c). Die Morphologie von Ti-PDA@SNP-OGP änderte sich nach NIR-Bestrahlung (1,00 W/cm2, 10 min) nicht (Zusatzdatei 1: Abb. S2d).

Die kumulativen NO-Konzentrationen, die aus Ti-PDA@SNP und Ti-PDA@SNP-OGP freigesetzt wurden, betrugen (15,9 ± 1,2) μmol/L bzw. (15,1 ± 1,1) μmol/L nach NIR-Bestrahlung nach 10 Minuten. Allerdings stieg die kumulative Konzentration von NO, die aus Ti-PDA@SNP oder Ti-PDA@SNP-OGP freigesetzt wurde, ohne NIR-Bestrahlung nicht an (Abb. 1g). Die kumulative NO-Konzentration, die aus NIR-bestrahltem Ti-PDA@SNP-OGP freigesetzt wurde, war signifikant erhöht (P <0,01, Zusatzdatei 1: Abb. S2e) und erreichte (34,6 ± 2,4) μmol/l nach 30 Minuten (Zusatzdatei 1). : Abb. S2f), der einen NIR-ausgelösten „Ein-Aus“-Schaltmodus für die NO-Freisetzung erzeugt (Zusatzdatei 1: Abb. S2g). Allerdings betrug die kumulative NO-Konzentration, die nach 72-stündiger Inkubation aus dem Ti-PDA@SNP-OGP freigesetzt wurde, nur (4,9 ± 0,8) μmol/L ohne NIR-Bestrahlung (Zusatzdatei 1: Abb. S2h).

Zur Untersuchung der Hemmung und Beseitigung von MRSA-Biofilmen auf Ti oder funktionalisiertem Ti-Substrat mit oder ohne NIR-Bestrahlung wurde ein Verdünnungs-Spread-Plating-Ansatz verwendet. Alle Substrate zeigten ohne NIR-Bestrahlung keine offensichtlichen bakteriostatischen Eigenschaften gegen MRSA-Kolonien. Im Gegenteil, die Anzahl der auf den Agarplatten gebildeten MRSA-Kolonien in Ti-PDA@SNP oder Ti-PDA@SNP-OGP war im Vergleich zu Ti nach NIR-Bestrahlung deutlich verringert (Abb. 2a). Nach 10 Minuten NIR-Bestrahlung betrugen die Eliminierungsraten von MRSA-Biofilmen durch Ti-PDA, Ti-PDA@SNP und Ti-PDA@SNP-OGP (62,4 ± 7,6) %, (98,7 ± 2,6) % und (97,6 ±). 4,7) % (Abb. 2b). Basierend auf REM-Bildern zeigte der MRSA eine sphärische und integrierte Membranstruktur auf Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP oder Ti-PDA@SNP-OGP ohne NIR-Bestrahlung. Nach NIR-Bestrahlung wurden MRSA-Biofilme in Ti-PDA teilweise zerstört, mit verwelkten und beschädigten (durch rote Pfeile angezeigten) Zellmembranen. Nach der NIR-Bestrahlung war die Morphologie der MRSA-Biofilme auf Ti immer noch glatt und kompakt. Im Gegensatz dazu wurden MRSA-Biofilme eliminiert und die Mehrheit der Bakterien war tot mit nicht fokussierbaren Rändern auf Ti-PDA@SNP oder Ti-PDA@SNP-OGP (Abb. 2c).

In-vitro-Anti-Biofilm-Aktivität von Ti-PDA@SNP-OGP mit oder ohne NIR-Bestrahlung. A. Repräsentative Bilder von MRSA-Kolonien in Agarplatten jeder Gruppe mit oder ohne NIR-Bestrahlung. b Eliminierungswirksamkeit von MRSA-Biofilmen basierend auf den Ergebnissen der Agarplatten in jeder Gruppe. c Rasterelektronenmikroskopische (REM) Bilder von MRSA-Biofilmen jeder Gruppe mit oder ohne NIR-Bestrahlung. Maßstabsbalken = 2 μm. Rote Pfeile zeigen die beschädigten Zellmembranen an. d ROS FL-Intensität von MRSA aus jeder Gruppe durch DCFH-DA-Sonde unter NIR-Bestrahlung. e Relative FL-Intensität von MRSA unter verschiedenen Bedingungen durch NPN-Fluoreszenzsonde, Polymyxin B wurde als Positivkontrolle verwendet. Die Fluoreszenzintensitäten der Versuchsgruppen wurden auf die von unberührtem Ti ohne NIR-Bestrahlung normalisiert. f Relative ATP-Intensität von MRSA in jeder Gruppe, gemessen mit einem Fluoreszenzspektrophotometer. Die relative Fluoreszenzintensität der Versuchsgruppen wurde durch Normalisierung der Fluoreszenzintensität auf die von unberührtem Ti ohne NIR-Bestrahlung ermittelt. g ONPG-Hydrolyse von MRSA aus jeder Gruppe unter Verwendung eines spektrophotometrischen Mikroplattenlesegeräts. **P < 0,01; Ti-Titan, PDA-Polydopamin-Nanopartikel, SNP-Natriumnitroprussid, OGP osteogenes Wachstumspeptid, NIR-Nahinfrarotlicht, MRSA-Methicillin-resistentes Staphylococcus aureus-Scannen, ROS-reaktive Sauerstoffspezies, DCFH-DA 2′,7′-Dichlorfluoresceindiacetat, NPN 1- N-Phenylnaphthylamin, FL-Fluoreszenz, ATP-Adenosintriphosphat, ONPG o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid

Die MRSA-Biofilme waren auf Ti, Ti-PDA, Ti-PDA@SNP oder Ti-PDA@SNP-OGP ohne NIR-Bestrahlung dunkelviolett gefärbt (Zusatzdatei 1: Abb. S3a). Nach der NIR-Bestrahlung wurde die Färbung auf Ti-PDA@SNP und Ti-PDA@SNP-OGP heller und die Biofilmbiomasse betrug 0,31 bzw. 0,37 (P <0,01, Zusatzdatei 1: Abb. S3b). Die Biofilmbiomasse verringerte sich nach 2 Minuten NIR-Bestrahlung auf Ti-PDA@SNP bzw. Ti-PDA@SNP-OGP auf 68,9 % bzw. 72,3 %. Wenn MRSA-Biofilme über längere Zeiträume (über 10 Minuten) bestrahlt wurden, wurde die Biofilmbiomasse auf Ti-PDA@SNP und Ti-PDA@SNP-OGP auf 8,1 % bzw. 13,3 % reduziert (Zusatzdatei 1: Abb. S3c). . Die Anti-Biofilm-Fähigkeit des Antibiotikums Vancomycin wurde weiter mit den Wirkungen verglichen, die mit Ti oder NIR-bestrahltem Ti-PDA@SNP-OGP erzielt wurden. Die MRSA-Lebensfähigkeit von Vancomycin betrug 29,6 % und war damit deutlich höher als die von NIR-bestrahltem Ti-PDA@SNP-OGP (8,3 %) (P <0,01, Zusatzdatei 1: Abb. S3d). Darüber hinaus war die relative Biofilmbiomasse in NIR-bestrahltem Ti-PDA@SNP-OGP signifikant niedriger (10,4 %) als die von Ti (100,0 %) und Vancomycin (95,6 %, P <0,01, Zusatzdatei 1: Abb. S3e). . Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Hyperthermie und photothermisch ausgelöste NO-Freisetzung durch Ti-PDA@SNP-OGP eine synergistische antibakterielle Wirkung gegen MRSA zeigten und MRSA-Biofilme wirksam beseitigen könnten.

Der ROS-Wert wurde mit einer DCFH-DA-Sonde untersucht. Nach NIR-Bestrahlung sind die ROS-Werte in Ti-PDA@SNP oder Ti-PDA@SNP-OGP im Vergleich zu Ti oder Ti-PDA viel höher (P <0,01; Abb. 2d). Im Vergleich dazu hatten alle Gruppen ohne NIR-Bestrahlung ähnliche ROS-Werte (Zusatzdatei 1: Abb. S3f). Ohne NIR-Bestrahlung war die relative FL-Intensität von Ti-PDA, Ti-PDA@SNP und Ti-PDA@SNP-OGP im Vergleich zur Ti-Gruppe offensichtlich nicht erhöht. Unter Laserbestrahlung wurden die relativen FL-Intensitäten von Ti-PDA@SNP und Ti-PDA@SNP-OGP signifikant erhöht, was der Positivkontrolle ähnelte (P <0, 01, Abb. 2e). Im Vergleich zu Ti wies Ti-PDA@SNP-OGP nach NIR-Bestrahlung einen stärkeren Rückgang der ATP-Intensität (~63,5 %) (Abb. 2f) und ein umfassenderes Ausmaß der BCA-Leckage (~2,6-fach) auf (Zusatzdatei 1: Abb. S3g). Im Gegensatz dazu gab es bei NIR-bestrahltem Ti-PDA nur eine Abnahme der ATP-Intensität um 30,5 % (Abb. 2f) und einen 1,75-fachen Anstieg der BCA-Leckage (Zusatzdatei 1: Abb. S3g). Die Hydrolyse von ONPG wurde verwendet, um das Ausmaß der bakteriellen Membranschädigung zu untersuchen (dh das Ausmaß der ONPG-Hydrolyse nimmt zu, wenn bakterielle Membranen beeinträchtigt sind). Ohne NIR-Bestrahlung waren die Unterschiede im Ausmaß der ONPG-Hydrolyse in Ti-PDA, Ti-PDA@SNP und Ti-PDA@SNP-OGP im Vergleich zu Ti vernachlässigbar. Nach NIR-Bestrahlung war das Ausmaß der ONPG-Hydrolyse in Ti-PDA@SNP oder Ti-PDA@SNP-OGP signifikant höher als das in Ti oder Ti-PDA (P <0,01, Abb. 2g). Darüber hinaus wurde die Dehydrogenaseaktivität der Atmungskette nach verschiedenen Behandlungen gemessen. Die Dehydrogenase der Atmungskette wurde in Ti-PDA@SNP oder Ti-PDA@SNP-OGP nach NIR-Bestrahlung inaktiviert (P <0,01, Zusatzdatei 1: Abb. S3h). Veränderungen der Membranpermeabilität von Bakterien gehen normalerweise mit dem Austreten intrazellulärer Komponenten wie Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA) einher. MRSA-Biofilme in Ti-PDA@SNP-OGP zeigten eine bemerkenswert hohe Konzentration des Austritts intrazellulärer Komponenten nach NIR-Bestrahlung (P <0,05 oder P <0,01, Zusatzdatei 1: Abb. S3i), was mit dem Ergebnis von ONPG übereinstimmt Hydrolyse. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass ROS-vermittelter oxidativer Stress, die Zerstörung der Bakterienmembranintegrität und das Austreten intrazellulärer Komponenten die Hauptfaktoren für den bakteriellen Tod und die Beseitigung von MRSA-Biofilmen waren, die durch Ti-PDA@SNP-OGP induziert wurden.

Die Morphologie und der Ausbreitungsbereich von MSCs wurden mittels Fluoreszenzfärbung bewertet. Wie in Abb. 3a gezeigt, zeigten auf Ti oder funktionalisiertem Ti-Substrat kultivierte MSCs eine spindelförmige Morphologie. Weitere Pseudopoden wurden aus MSCs identifiziert, die auf Ti-PDA@SNP-OGP kultiviert wurden. Die quantitative Analyse ergab, dass der Ausbreitungsbereich von MSCs auf Ti-PDA@SNP-OGP im Vergleich zu anderen Gruppen größer war (P <0,01, Zusatzdatei 1: Abb. S4a). Die Zelllebensfähigkeit von MSCs wurde mithilfe des CCK-8-Assays nach 1, 4 und 7 Tagen Kultivierung bewertet. Im Vergleich zu auf Ti, Ti-PDA und Ti-PDA@SNP kultivierten Zellen war die Zelllebensfähigkeit von auf Ti-PDA@SNP-OGP kultivierten MSCs signifikant höher (P < 0,05 oder P < 0,01, Abb. 3b). Nach 10-minütiger NIR-Bestrahlung war die Zelllebensfähigkeit von MSCs in Ti auf 85,4 % reduziert, was höher war als in Ti-PDA (68,9 %), Ti-PDA@SNP (53,2 %) und Ti-PDA@SNP- OGP (58,8 %) bzw. (P < 0,01, Zusatzdatei 1: Abb. S4b). Unterdessen waren die Zelllebensfähigkeiten in Ti-PDA@SNP und Ti-PDA@SNP-OGP deutlich geringer als die in Ti-PDA (P <0,05, Zusatzdatei 1: Abb. S4b). Anschließend wurden die Zellen unter normalen Bedingungen weiter kultiviert, und es wurde festgestellt, dass die Zelllebensfähigkeit von MSCs nach 1 Tag auf Ti-PDA@SNP-OGP signifikant verringert war als auf Ti (P < 0,01). Am 4. Tag wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen Ti- und Ti-PDA@SNP-OGP-Gruppen festgestellt (P > 0,05), wohingegen am 7. Tag ein signifikanter Unterschied festgestellt wurde (P <0,01, Zusatzdatei 1: Abb. S4c). Die Zelllebensfähigkeit (bestimmt mittels LDH-Assay) von MSCs, die auf NIR-bestrahltem Ti-PDA@SNP-OGP kultiviert wurden, entsprach in etwa der der positiven Kontrollgruppe (MSCs, die auf Ti ohne MSRA kultiviert wurden). Nach NIR-Bestrahlung waren die Lebensfähigkeiten der Zellen in Ti, Ti-PDA und Ti-PDA@SNP jedoch deutlich geringer als in Ti-PDA@SNP-OGP (P <0,01, Zusatzdatei 1: Abb. S4d). Nach der Eliminierung des Biofilms führten wir die Fluoreszenzfärbung und den ALP-Aktivitätstest durch, um das osteogene Potenzial von Ti-PDA@SNP-OGP zu bewerten. Als Kontrolle wurde Ti-PDA@SNP-OGP (neu) ohne NIR-Bestrahlung verwendet. Auf Ti-PDA@SNP-OGP (gebraucht) und Ti-PDA@SNP-OGP (neu) kultivierte MSCs zeigten ähnliche normale Morphologien und es wurden keine offensichtlichen Unterschiede gefunden, was indirekt darauf hindeutet, dass NIR-bestrahltes Ti-PDA@SNP-OGP dies effektiv tun konnte MRSA-Biofilme beseitigen, aber die biologische Funktion von MSCs nicht beeinträchtigen (Zusatzdatei 1: Abb. S4e). Darüber hinaus war die ALP-Aktivität von MSCs in Ti-PDA@SNP-OGP (nach der Beseitigung von MRSA-Biofilmen) signifikant höher (P <0,05) als die in Ti (Zusatzdatei 1: Abb. S4f).

Zellproliferations- und Osteogenesebewertung von MSCs auf Ti oder funktionalisiertem Ti-Substrat. a Fluoreszenzbilder von MSCs auf Ti oder funktionalisiertem Ti-Substrat, Hoechst 33258 (blau) und Actin (rot). Maßstabsbalken = 200 μm. b Zellproliferation von MSCs auf Ti oder funktionalisiertem Ti-Substrat durch CCK-8-Assay. c ALP-Aktivität von MSCs auf Ti oder funktionalisiertem Ti-Substrat nach 7-tägiger Inkubation. d Die Kollagensekretion von MSCs auf Ti oder funktionalisiertem Ti-Substrat wurde durch Sirius-Rot-Färbung nachgewiesen und quantifiziert. Die ECM-Mineralisierung von MSCs in jeder Probe wurde durch Alizarinrot-Färbung gemessen und quantifiziert. f mRNA-Expression der Osteogenese-bezogenen Gene Runx2, BMP2, OPN und OCN, gemessen durch qRT-PCR. *P < 0,05, **P < 0,01; Ti-Titan, PDA-Polydopamin-Nanopartikel, SNP-Natriumnitroprussid, OGP-Osteogenes-Wachstumspeptid, MSCs-Markstromazellen, ALP-alkalische Phosphatase, extrazelluläre ECM-Matrix, Runx2-Runt-bezogener Transkriptionsfaktor 2, BMP2-Knochenmorphogenetikprotein 2, OPN-Osteopontin, OCN-Osteocalcin, qRT ‑PCR quantitative Echtzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion

Nach 7-tägiger Kultivierung zeigten MSCs, die auf Ti-PDA@SNP-OGP kultiviert wurden, eine höhere ALP-Aktivität als diejenigen in anderen Gruppen (P <0, 01, Abb. 3c). Ein ähnlicher Trend wurde für die Kollagensekretion und die ECM-Mineralisierung beobachtet (Abb. 3d, e). qRT-PCR wurde verwendet, um die mRNA-Expressionsprofile osteogenesebezogener Gene [Runt-bezogener Transkriptionsfaktor 2 (Runx2), Knochenmorphogenetisches Protein 2 (BMP2), Osteopontin (OPN), Osteocalcin (OCN)] in MSCs zu untersuchen Es wurde festgestellt, dass die Expressionsniveaus von Runx2, BMP2, OPN und OCN in Ti-PDA@SNP-OGP deutlich höher waren als in anderen Gruppen (P <0,05 oder P <0,01, Abb. 3f).

Die Morphologie von RAW264.7-Zellen, die auf Ti oder funktionalisiertem Ti-Substrat kultiviert wurden, wurde zunächst durch Fluoreszenzfärbung beobachtet. In auf Ti-PDA@SNP-OGP kultivierten RAW264.7-Zellen wurden mehr Pseudopodien (angezeigt durch weiße Kreise mit gepunkteten Linien) beobachtet als auf Ti, Ti-PDA oder Ti-PDA@SNP kultivierte Zellen (Abb. 4a). SEM-Bilder zeigten, dass im Vergleich zu anderen Gruppen mehr RAW264.7-Zellen am Ti-PDA@SNP-OGP-Substrat hafteten (Abb. 4b). Darüber hinaus steigerte Ti-PDA@SNP-OGP die Proliferation der RAW264.7-Zellen im Vergleich deutlich mit anderen Gruppen (P < 0,01, Abb. 4c). Darüber hinaus wurde die Polarisation der Makrophagen auch mittels qRT-PCR bewertet. Wie in Abb. 4d gezeigt, zeigten die M1-Markergene (CD86, iNOS und CD11C) einen signifikanten Abwärtstrend von Ti-PDA@SNP-OGP im Vergleich zu anderen Gruppen (P <0,05 oder P <0,01), was auf ihre entzündungshemmende Aktivität schließen lässt . Im Vergleich dazu wurden die mRNA-Expressionsniveaus der M2-Markergene (CD206, Arg-1 und CD163) durch Ti-PDA@SNP-OGP im Vergleich zu Ti, Ti-PDA oder Ti-PDA@SNP signifikant hochreguliert (P < 0,01). ).

Auswirkungen von Ti oder funktionalisiertem Ti-Substrat auf die Neuprogrammierung des Makrophagen-Phänotyps und die entzündungshemmende Kapazität in vitro. a Zytoskelett-Färbung von RAW 264.7-Zellen auf Ti- oder funktionalisiertem Ti-Substrat nach 24-stündiger Kultivierung, Hoechst 33258 (blau) und Actin (rot). Maßstabsbalken = 50 μm. Weiße gepunktete Kreise stellen das Pseudopodium dar. b Rasterelektronenmikroskopische (REM) Bilder von RAW264.7-Zellen auf Ti oder funktionalisiertem Ti-Substrat nach 24-stündiger Kultivierung. Maßstabsbalken = 5 μm. c Zelllebensfähigkeit von RAW264.7-Zellen in verschiedenen Proben nach 1, 3 und 5 Tagen Kultivierung. d mRNA-Expression der M1-Markergene CD86, iNOS und CD11C und der M2-Markergene CD206, Arg-1 und CD163 in Lipopolysaccharid (LPS)-stimulierten RAW264.7-Zellen. e mRNA-Expression der Gene Runx2, BMP2, VEGF und TGF-β in RAW264.7-Zellen. f mRNA-Expression der proinflammatorischen Gene IL-1β und TNF-α und der entzündungshemmenden Gene IL-1ra und IL-10 in LPS-stimulierten RAW264.7-Zellen. *P < 0,05, **P < 0,01; Ti-Titan, PDA-Polydopamin-Nanopartikel, SNP-Natriumnitroprussid, OGP osteogenes Wachstumspeptid, CD86-Differenzierungscluster 86, iNOS-induzierbare Stickoxidsynthase, CD11C-Differenzierungscluster 11C, CD206-Differenzierungscluster 206, Arg-1-Arginase-1, CD163-Cluster von Differenzierung 163, Runx2 Runt-Related Transcription Factor 2, BMP2 Bone Morphogenetic Protein 2, VEGF Vascular Endothelial Growth Factor, TGF-β Transforming Growth Factor-β, IL-1β Interleukin-1β, TNF-α Tumornekrosefaktor-α, IL- 1ra-Interleukin-1ra, IL-10-Interleukin-10

Die mRNA-Expressionsniveaus von Runx2, BMP2, VEGF und TGF-β wurden in RAW264.7-Zellen weiter untersucht. Im Vergleich zu Ti stiegen die mRNA-Expressionsniveaus von Runx2, BMP2, VEGF und TGF-β in Ti-PDA@SNP-OGP um das 1,8-, 2,5-, 3,1- bzw. 2,7-fache (P <0,01, Abb. 4e). Das entzündungshemmende Potenzial von Ti-PDA@SNP-OGP wurde ebenfalls bewertet. Im Vergleich zu anderen Gruppen waren die mRNA-Expressionsniveaus der proinflammatorischen Gene IL-1β und TNF-α in Ti-PDA@SNP-OGP herunterreguliert, wohingegen sich bei höherer mRNA-Expression der entzündungshemmenden Gene IL die gegenteilige Tendenz zeigte -1ra und IL-10 (P < 0,01, Abb. 4f). Zusammengenommen unterstreichen diese Ergebnisse die fördernde Wirkung von Ti-PDA@SNP-OGP, um die nachteilige proinflammatorische Mikroumgebung umzukehren und die Makrophagen in den M2-Phänotyp umzuprogrammieren und so eine proregenerative Mikroumgebung zu schaffen.

Das osteogene Differenzierungspotenzial von MSCs und die Expression von Entzündungsfaktoren durch RAW264.7-Zellen nach NIR-Bestrahlung wurden bewertet. Es wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen Ti-PDA@SNP-OGP und NIR-bestrahltem Ti-PDA@SNP-OGP (P > 0,05) gefunden, wohingegen die Mineralisierung von MSCs in Ti-PDA@SNP-OGP nach NIR höher war als in anderen Gruppen Bestrahlung (P <0,01, Zusatzdatei 1: Abb. S4g). Darüber hinaus war nach 10-minütiger NIR-Bestrahlung das mRNA-Expressionsniveau des M1-Markers CD86 in Ti-PDA@SNP-OGP in RAW264.7-Zellen signifikant niedriger als in anderen Gruppen (P <0,01, Zusatzdatei 1: Abb. S4h). Darüber hinaus gab es keine statistisch signifikanten Unterschiede im Expressionsniveau von CD86 zwischen Ti-PDA@SNP-OGP und NIR-bestrahltem Ti-PDA@SNP-OGP (P > 0,05). Ein entgegengesetzter Trend wurde für die Expression des M2-Markers CD206 in RAW264.7-Zellen beobachtet (Zusatzdatei 1: Abb. S4h). Nach der Eliminierung des Biofilms wurde die Wechselwirkung von MSCs mit dem verwendeten Ti-PDA@SNP-OGP in vitro mithilfe von CCK-8- und ALP-Aktivitätstests untersucht. MSCs auf Ti-PDA@SNP-OGP, die zum ersten oder zweiten Mal verwendet wurden, zeigten eine deutlich höhere Lebensfähigkeit der Zellen als diejenigen auf Ti oder Ti-PDA@SNP-OGP, die dreimal verwendet wurden (P < 0,05 oder P < 0,01, Zusatzdatei 1: Abb. S4i). In ähnlicher Weise waren die ALP-Aktivitäten von MSCs auf Ti-PDA@SNP-OGP, die zum ersten oder zweiten Mal verwendet wurden, höher als die auf Ti oder Ti-PDA@SNP-OGP, die dreimal nach 7-tägiger Inkubation verwendet wurden (P < 0,05, zusätzlich). Datei 1: Abb. S4j). Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass Hyperthermie und photothermisch ausgelöste NO-Freisetzung durch Ti-PDA@SNP-OGP zweimal wiederholt werden können, um die etablierten Biofilme zu beseitigen und die osteogene Differenzierung der MSCs nach der Biofilm-Eradikation zu verbessern.

Es wurde festgestellt, dass RAW264.7-Zellen, die Ti-PDA@SNP-OGP ausgesetzt waren, eine signifikant erhöhte mRNA- und Proteinexpression von Runx2, BMP2, VEGF und TGF-β aufwiesen (P <0,01, Zusatzdatei 1: Abb. S5a, b). Darüber hinaus wurde ein Transwell-Co-Kultursystem verwendet, um die in vitro fördernde osteogene Wirkung von RAW264.7-Zellen, die durch Ti-PDA@SNP-OGP auf MSCs induziert wird, weiter zu bewerten. RAW264.7-Zellen wurden auf verschiedenen Substraten in der unteren Kammer ausgesät und MSCs wurden in der oberen Kammer kultiviert (Zusatzdatei 1: Abb. S5c). Nach eintägiger Kokultur wurden mehr migrierte MSCs in Ti-PDA@SNP-OGP gefunden (Zusatzdatei 1: Abb. S5d), das unter allen Gruppen die höchste Transmembranmigration aufwies (P <0, 05 oder P <0, 01). Die quantitative Analyse zeigte, dass die ALP-Aktivität, die Kollagensekretion und die ECM-Mineralisierung von MSCs in Ti-PDA@SNP-OGP signifikant höher waren als in anderen Gruppen (P < 0,01). In ähnlicher Weise wurden in Ti-PDA@SNP-OGP größere, mit Sirius rot gefärbte Bereiche von Kollagenfasern und mit Alizarin rot gefärbte Bereiche von Kalziumablagerungen gefunden (Zusatzdatei 1: Abb. S5e). Darüber hinaus waren die Expressionsniveaus der Osteogenese-bezogenen Gene Runx2, BMP2, ALP, OPN und OCN in der Ti-PDA@SNP-OGP-Gruppe am höchsten (P <0,01, Zusatzdatei 1: Abb. S5f).

Um die In-vitro-Ergebnisse zu verifizieren, wurde erfolgreich ein MRSA-infiziertes Femurdefekt-Implantationsmodell etabliert (Zusatzdatei 1: Abb. S6a). REM-Bilder zeigten, dass Ti-PDA@SNP-OGP während der Implantation nicht beschädigt wurde (Zusatzdatei 1: Abb. S6b). Vor der Implantation wurden Ti- und Ti-PDA@SNP-OGP-Stäbe 2 Tage lang mit MRSA-Biofilmen inkubiert. Die Bildung von MRSA-Biofilmen auf Implantaten wurde mit REM untersucht. Es wurde festgestellt, dass alle Implantate nach 2-tägiger Inkubation mit MRSA-Suspension mit MRSA-Biofilmen bedeckt waren (Zusatzdatei 1: Abb. S6c). Der anhaftende MRSA auf allen Implantaten wurde durch Ultraschallenergie entfernt. Die quantitative Analyse zeigte, dass MRSA in Ti (2,71 × 107 KBE), Ti-PDA (2,60 × 107 KBE), Ti-PDA@SNP (2,46 × 107 KBE) und Ti-PDA@SNP-OGP (2,66 ×) gefunden werden konnte 107 KBE).

Einen Tag nach der Implantation wurden die Implantationsstellen des Ti- oder Ti-PDA@SNP-OGP-Implantats einer Laserbestrahlung bei 808 nm ausgesetzt. Es wurden photothermische Bilder und entsprechende Temperaturänderungen aufgezeichnet (Zusatzdatei 1: Abb. S6d). Nach 10-minütiger Bestrahlung betrug die Temperaturänderung (∆T) des Ti-PDA@SNP-OGP-Implantats 23,7 °C und war damit deutlich höher als die des Ti-Implantats (12,1 °C, P < 0,01, Zusatzdatei 1). : Abb. S6e). Nach einer dreitägigen Implantation wurden beide Implantate vorsichtig entfernt und 12 Stunden lang in MHB eingeweicht. Nach der Inkubation im Dunkeln war das MHB-Medium, das das Ti- oder Ti-PDA@SNP-OGP-Implantat enthielt, fäkal. Dies ist ein Hinweis auf die unzureichende antibakterielle Wirkung von Ti und Ti-PDA@SNP-OGP ohne NIR-Bestrahlung. Nach der NIR-Bestrahlung wurde das MHB-Medium mit dem Ti-PDA@SNP-OGP-Implantat klar, während das MHB-Medium mit dem Ti-Implantat fäkal blieb (Zusatzdatei 1: Abb. S6f). Die quantitative Analyse der Streuplatten ergab, dass ohne NIR-Bestrahlung nur 6,2 % der MRSA-Biofilme entfernt wurden. Im Gegensatz dazu wurden über 95,7 % der MRSA-Biofilme auf dem Ti-PDA@SNP-OGP-Implantat nach NIR-Bestrahlung beseitigt (P <0,01, Zusatzdatei 1: Abb. S6g). Mithilfe der induktiv gekoppelten Plasma-Atomemissionsspektroskopie (ICP-AES) wurde der Gehalt an Fe-Ionen im intraluminalen Femurmark untersucht, um den In-vivo-Abbau von Ti-PDA@SNP-OGP zu festgelegten Zeitpunkten (0,5, 1, 3, 7, 14 und 28 d). Der Prozentsatz der Fe-Ionen, die sich im intraluminalen Femurmark ansammelten, betrug nach 28 Tagen 7,54 % in Ti-PDA@SNP-OGP. Bemerkenswerterweise betrug die Halbwertszeit von OGP im Ti-PDA@SNP-OGP-Substrat in vivo etwa 7 Tage. Im Gegensatz dazu betrug die kumulative Menge an Fe-Ionen in Ti nur 0,9 % (P <0,01, Zusatzdatei 1: Abb. S6h). Insgesamt zeigte die mikrobiologische Bewertung, dass das Ti-PDA@SNP-OGP-Implantat in vivo eine kombinierte photothermische und antibakterielle NO- sowie MRSA-Biofilm-Eradikationswirkung zeigte.

Um das entzündungshemmende Potenzial zu bewerten, wurde ein ELISA durchgeführt, um die Konzentration der ausscheidenden proinflammatorischen (TNF-α und IL-6) und antiinflammatorischen Zytokine (TGF-β und IL-10) zu quantifizieren. NIR-bestrahltes Ti-PDA@SNP-OGP hatte die niedrigsten Proteinexpressionsniveaus von TNF-α und IL-6 (P <0,01, Zusatzdatei 1: Abb. S6i). Die Gehalte an TNF-α und IL-6 waren in Ti-PDA@SNP-OGP signifikant höher als in NIR-bestrahltem Ti-PDA@SNP-OGP, wohingegen sich bei höheren Gehalten an entzündungshemmenden Zytokinen TGF eine gegenteilige Tendenz zeigte -β und IL-10, die von letzterem sezerniert werden (P <0, 01, Zusatzdatei 1: Abb. S6i), was der photothermisch ausgelösten NO-Erzeugung zugeschrieben wurde.

HE- und Giemsa-Färbungen wurden verwendet, um die Entzündungsreaktion 3 Tage nach der Implantation in vivo zu analysieren. In NIR-bestrahltem Ti-PDA@SNP-OGP wurden nur wenige Entzündungszellen (angezeigt durch rote Pfeile) und Restbakterien (angezeigt durch rote Pfeile) identifiziert, was durch quantitative Ergebnisse (P < 0,05 oder P < 0,01) weiter bestätigt wurde. Zusatzdatei 1: Abb. S7a). Umgekehrt wurde in anderen Gruppen eine starke Infiltration von Entzündungszellen und vielen MRSA-Zellen beobachtet (P <0,01, Zusatzdatei 1: Abb. S7b).

An der Knochen-Implantat-Grenzfläche wurde eine IHC-Färbung für M1-Makrophagen mit CD86 und M2-Makrophagen mit CD206 durchgeführt (Zusatzdatei 1: Abb. S7c). In NIR-bestrahltem Ti-PDA@SNP-OGP zeigte die Verteilung von CD86-positiven Makrophagen einen bemerkenswerten Rückgang, wohingegen sie einen überwiegend stärkeren Trend von CD206-positiven Makrophagen aufwiesen. Zusammenfassend belegen diese Ergebnisse das Potenzial des Implantats, Entzündungshemmung und Neuprogrammierung des Makrophagen-Phänotyps zu vermitteln, was mit den In-vitro-Ergebnissen übereinstimmt.

Wie in Abb. 5a gezeigt, wurde in der Ti-PDA@SNP-OGP-Gruppe, die einer NIR-Bestrahlung ausgesetzt war, eine stärkere Knochenneubildung beobachtet. Die Prozentsätze des neuen Knochenvolumens am gesamten Knochenvolumen (BV/TV), die Trabekelplattendicke (Tb.Th), die Trabekelzahl (Tb.N) und die Trabekeltrennung (Tb.Sp) wurden untersucht und berechnet. Die höchsten Anteile an BV/TV, Tb.Th und Tb.N und der niedrigste Anteil an Tb.Sp wurden in NIR-bestrahltem Ti-PDA@SNP-OGP gefunden (Abb. 5b, Zusatzdatei 1: Abb. S7d) . Wie in Abb. 5c gezeigt, wurde auf der Oberfläche von NIR-bestrahltem Ti-PDA@SNP-OGP eine reichliche Bildung neuen Knochengewebes beobachtet, während in Ti, NIR-bestrahltem Ti oder Ti-PDA nur eine geringe Menge neuen Knochens gefunden wurde @SNP-OGP nach 4 Wochen Behandlung. Ähnliche Ergebnisse wurden für die Trichrom-Färbung nach Masson erhalten. NIR-bestrahltes Ti-PDA@SNP-OGP zeigte den höchsten Prozentsatz der neuen Knochenfläche (37,5 %) und des Knochen-Implantat-Kontakts (34,3 %) (P < 0,05 oder P < 0,01, Zusatzdatei 1: Abb. S7e ), im Einklang mit den Ergebnissen der Mikro-CT. Eine weitere Auswertung der knochenbildenden Proteine ​​(ALP und OPN) um das periimplantäre Knochengewebe mit IHC-Färbung ergab, dass ALP- und OPN-Bereiche in Ti-PDA@SNP-OGP stärker positiv gefärbt sind. Im Vergleich zu Ti, NIR-bestrahltem Ti und Ti-PDA@SNP-OGP zeigte NIR-bestrahltes Ti-PDA@SNP-OGP eine deutlich verbesserte CD31-Expression (Vaskularisierungsmarker) um die Implantate herum (Zusatzdatei 1: Abb. S7f).

Knochenregeneration in einem MRSA-infizierten femoralen Defektimplantationsmodell in vivo. a Mikro-CT-Bilder von neuem Knochen. Maßstabsbalken = 400 μm. b Quantitative Analyse von neu gebildetem Knochengewebe basierend auf dreidimensionalen (3D) Rekonstruktionsbildern der Mikro-CT, einschließlich Knochenvolumen/Gesamtvolumen (BV/TV), Trabekeldicke (Tb.Th) und Trabekelzahl (Tb. N) nach 4 Wochen. c Repräsentative Bilder der HE- und Masson-Trichrom-Färbung an der Knochen-Implantat-Grenzfläche. Maßstabsbalken = 200 μm. **P < 0,01; Ti-Titan, PDA-Polydopamin-Nanopartikel, SNP-Natriumnitroprussid, osteogenes Wachstumspeptid OGP, HE-Hämatoxylin und Eosin

Die biologische Sicherheit der durch PTT von Ti-PDA@SNP-OGP in vivo induzierten milden Temperatur (~51 °C) wurde mithilfe biochemischer Vollblutanalysen bewertet, einschließlich weißer Blutkörperchen (WBC), neutrophiler Granulozyten (NEUT) und roter Blutkörperchen ( RBC), Hämoglobin (HGB), Hämatokrit (HCT) und Blutplättchen (PLT). Es wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen Ti und NIR-bestrahltem Ti-PDA@SNP-OGP für die Indikatoren WBC, NEUT, RBC, HGB, HCT und PLT gefunden (Zusatzdatei 1: Abb. S8). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass mit der Ti-PDA@SNP-OGP- und NIR-Therapie im Körper keine offensichtlichen Risiken verbunden sind.

In dieser Studie wurden PDA-Nanopartikel mit photothermisch empfindlichem SNP verkapselt und mit OGP modifiziert, und auf Ti wurde eine Dopaminbeschichtung gebildet, um PDA@SNP-OGP-Nanopartikel zu laden und Ti-PDA@SNP-OGP zu konstruieren (Abb. 6). Als osteogener Faktor wird OGP häufig verwendet, um das osteogene Differenzierungspotenzial von Knochenreparaturmaterialien zu steigern, indem die Proliferation und Differenzierung von Zellen der Osteoblastenlinie in vivo verbessert wird. In unseren früheren Studien wurde OGP als wirksamer osteoimmunmodulatorischer Faktor zur Verbesserung der entzündungshemmenden Fähigkeit von RAW264.7-Zellen und zur Verstärkung der osteogenen Wirkung von MSCs identifiziert [41,42,43]. Bai et al. [44] stellten ein tetravalentes Catechol enthaltendes (DOPA)4-modifiziertes OGP mit Muscheladhäsion und osteoimmunmodulatorischen Funktionen für eine fortgeschrittene Osseointegration durch Unterdrückung von Entzündungsreaktionen und Hochregulierung des M2-Phänotyps von Makrophagen her. Aufgrund der geringen antibakteriellen Kapazität waren die Einsatzmöglichkeiten der OGP-modifizierten Ti-Implantate in der Klinik jedoch äußerst begrenzt [44,45,46]. Zahlreiche Studien haben sich ausschließlich auf die Funktionalisierung von OGP-modifizierten Ti-Implantaten konzentriert, beispielsweise auf Einzelfunktion (antibakterielle Kapazität oder verbesserte Osseointegration) oder Doppelfunktion (einschließlich antibakterieller Kapazität und verbesserte Osseointegration). Diese Ansätze verbessern jedoch nicht die Osseointegration des Implantats bei Vorliegen mehrerer Komorbiditäten (z. B. bakterielle Infektion, Entzündung). Das Auftreten von MRSA und seinen Biofilmen auf den Oberflächen von Ti-Implantaten verschärft die Situation und führt daher zum Versagen von Ti-Implantaten [47]. Aus diesem Grund haben wir eine multifunktionalisierte Beschichtung auf Ti entwickelt, die den Crosstalk zwischen RAW264.7-Zellen und MSCs regulieren kann, um die Osseointegration zu verbessern und durch NIR-Bestrahlung antibakterielle und Biofilm-eliminierende Kapazitäten bereitzustellen.

Schematische Diagramme, die zeigen, dass Ti-PDA@SNP-OGP MSRA-Biofilme durch photothermisch ausgelöstes NO und Immuntherapie für eine verbesserte Osseointegration eliminiert. Ti-Titan, PDA-Polydopamin-Nanopartikel, SNP-Natriumnitroprussid, OGP-Osteogenes-Wachstumspeptid, NO-Stickoxid, VEGF-Vascular-Endothelial-Wachstumsfaktor, TGF-β-transformierender Wachstumsfaktor-β, IL-10-Interleukin-10, TNF-α-Tumornekrosefaktor-α

Aufgrund der hervorragenden photothermischen Wirkung von PDA wurde die durch laserbestrahlte Lichtenergie induzierte lokalisierte Hyperthermie zur Beseitigung etablierter Biofilme häufig eingesetzt [21, 23]. Der Temperaturanstieg durch ein photothermisches Mittel hängt von Faktoren wie seiner Konzentration, Laserdichte, Laserbestrahlungszeit und Umgebungstemperatur ab [20, 21]. Allerdings werden die Biofilme nur durch die Anwendung von NIR-Bestrahlung bei 70 °C beseitigt. Eine solche Temperatur verringert unvermeidlich die Lebensfähigkeit der Wirtszelle, indem sie Apoptose oder Nekrose auslöst [48]. Im Gegensatz dazu führt die durch PTT induzierte milde Temperatur (~52 °C) zu weniger nachteiligen Auswirkungen, aber auch die antibakteriellen und biofilmbeseitigenden Fähigkeiten sind bei dieser milden Temperatur deutlich reduziert [23]. In dieser Studie wandelte Ti-PDA@SNP-OGP laserbestrahlte Lichtenergie in lokalisierte Hyperthermie um. Die erhöhte Gewebetemperatur wiederum löste eine „bedarfsgesteuerte“ NO-Freisetzung aus SNP aufgrund der Zerstörung der π-π-Stapelung und/oder der physikalischen Adsorption zwischen SNP und PDA-Nanopartikeln aus [40]. Um die nachteiligen Auswirkungen zu minimieren, wurden 0,5 mg/ml PDA@SNP-OGP-Nanopartikel mit einer Laserintensität von 1,0 W/cm2 für 10 Minuten verwendet, um den photothermischen Effekt zu untersuchen, und die Temperatur erreichte etwa 52 °C. Die durch Ti-PDA@SNP-OGP erzeugte Hyperthermie könnte die Bakterienmembran zerstören und anschließend zum Proteinaustritt von MRSA führen, was zu der gewünschten antibakteriellen Kapazität führt. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Studien überein (49, 50). Die Freisetzung von NO kann die antibakterielle Wirkung verbessern, indem es nitrosativen und oxidativen Stress verursacht und den bakteriellen Stickstoffstoffwechsel stört [51, 52]. Basierend auf diesen Ergebnissen ist die kontrollierbare und schnelle Freisetzung von NO durch NIR-Bestrahlung ein nützliches Rüstzeug für die Beseitigung von Biofilmen innerhalb kurzer Zeit und erfordert keine exorbitanten Temperaturen.

Ideale Implantate sollten eine hervorragende Zytokompatibilität zur Regulierung der grundlegenden Funktionen osteogenesebezogener Zellen aufweisen [53, 54]. Die Lebensfähigkeit der Zellen, die ALP-Aktivität, die Kollagensekretion und die ECM-Mineralisierung werden durch Ti-PDA@SNP-OGP deutlich verbessert. In dieser Studie waren die osteogenesebezogenen Gene Runx2, BMP2, OPN und OCN in Ti-PDA@SNP-OGP im Vergleich zu anderen Gruppen signifikant hochreguliert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Ti-PDA@SNP-OGP das Potenzial hat, die osteogene Differenzierung von MSCs zu verbessern [42, 43].

Sobald das Implantat in das Knochengewebe eingebettet ist, werden innerhalb weniger Stunden Immunzellen wie Makrophagen an der Implantatstelle rekrutiert. Diese Immunzellen erzeugen eine Kaskade von Ereignissen, die zu einer frühen Entzündungsreaktion führen [55,56,57,58,59]. Eine Entzündungsreaktion ist für die Verbesserung der Knochenheilung von Vorteil, da Knochen-MSCs rekrutiert und die Angiogenese stimuliert wird [60,61,62]. Im Spätstadium der Entzündung polarisieren M1-Makrophagen in den M2-Phänotyp, um Entzündungen zu lindern und entzündungshemmende Zytokine abzusondern, um die Knochenregeneration zu erleichtern [63,64,65,66,67]. Dennoch sind die multifunktionalen Makrophagen unter pathologischen Bedingungen nicht in der Lage, einen phänotypischen Übergang zu vollziehen [59]. Anhaltende und schwere Entzündungen führen zu erhöhten Spiegeln entzündungsfördernder Zytokine im umgebenden Knochengewebe. Diese entzündungsfördernden Zytokine steigern die Aktivität von Osteoklasten und verringern die Rekrutierung oder Migration von MSCs. Dies führt zu einer Knochentrennung und einer schlechten Osseointegration [68,69,70,71,72]. In dieser Studie regulierte Ti-PDA@SNP-OGP die mRNA-Expressionsniveaus der M1-Marker CD86, iNOS und CD11C signifikant herunter und regulierte die mRNA-Expressionsniveaus der M2-Marker CD206, Arg-1 und CD163 hoch. Außerdem wurden die mRNA-Expressionsniveaus der Gene Runx2, BMP2, VEGF und TGF-β durch Ti-PDA@SNP-OGP signifikant hochreguliert. Darüber hinaus hemmte Ti-PDA@SNP-OGP im Vergleich zu anderen Gruppen auch die mRNA-Expressionsniveaus der proinflammatorischen Zytokine IL-1β und TNF-α und verstärkte die Expression der entzündungshemmenden Zytokine IL-1ra und IL-10. Dies könnte auf die osteoimmunmodulatorische Wirkung von Ti-PDA@SNP-OGP zurückzuführen sein [42, 46].

Der Crosstalk zwischen MSCs und RAW264.7-Zellen spielt eine entscheidende Rolle bei der Verbesserung der Osseointegration von Implantaten [72,73,74]. Daher sollte der osteogene Induktionseffekt von RAW264.7-Zellen auf MSCs bei der Stimulation von Ti-PDA@SNP-OGP sorgfältig berücksichtigt werden. Die mRNA- und Proteinexpression von Runx2, BMP2, VEGF und TGF-β in RAW264.7-Zellen wurde hochreguliert, was möglicherweise auf die Immobilisierung von OGP auf Ti zurückzuführen ist, um RAW264.7-Zellen zur Sekretion osteogener Mediatoren zu stimulieren [44, 46]. Die MSCs in Ti-PDA@SNP-OGP zeigten nach Co-Kultivierung mit RAW264.7-Zellen die höchste Transmembranmigration aller Gruppen. Darüber hinaus waren die ALP-Aktivität, die Kollagensekretion und die ECM-Mineralisierung in Ti-PDA@SNP-OGP höher als in Ti, Ti-PDA oder Ti-PDA@SNP. Darüber hinaus stimulierte Ti-PDA@SNP-OGP nachweislich die Expression der Osteogenese-bezogenen Gene Runx2, BMP2, ALP, OPN und OCN in MSCs. Basierend auf den oben genannten Ergebnissen schlugen wir vor, dass Ti-PDA@SNP-OGP ein potenziell wirksamer Knochenimmunmodulator ist, der die Freisetzung entzündungshemmender Mediatoren aus RAW264.7-Zellen verstärkt, um die Migration und Differenzierung von MSCs über mehrere parakrine Signale zu verbessern von Runx2, BMP2, VEGF und TGF-β.

Zur Bewertung der antibakteriellen und entzündungshemmenden Fähigkeiten in vivo wurden über 95,7 % der MRSA-Biofilme auf Ti-PDA@SNP-OGP-Implantaten nach NIR-Bestrahlung beseitigt. Außerdem wurden in Ti-PDA@SNP-OGP nach NIR-Bestrahlung nur wenige Entzündungszellen und Restbakterien beobachtet, was auf die synergistischen Effekte von milder Hyperthermie und photothermisch ausgelöster NO-Freisetzung auf die Eliminierung von MRSA-Biofilmen zurückzuführen ist [17, 23]. Die potenziellen antibakteriellen Mechanismen für unser entworfenes Ti-PDA@SNP-OGP wurden im Folgenden erläutert. Erstens macht Hyperthermie Bakterien empfindlicher gegenüber der äußeren Umgebung und kann anschließend die Bakterienmembran effizient schädigen, was möglicherweise eine entscheidende Rolle bei der Beseitigung von MRSA-Biofilmen spielt. Zweitens könnte photothermisch ausgelöstes NO den Stickstoffstoffwechsel unterbrechen, nitrosativen/oxidativen Stress auslösen und zum Tod von MRSA führen. Drittens kann eine Immuntherapie die Abwehr des Wirts gegen invasive Bakterien verbessern und die antibakterielle Eigenschaft gegen die restlichen Bakterien verstärken [75]. Darüber hinaus besitzt Ti-PDA@SNP-OGP eine bessere Fähigkeit, Entzündungsreaktionen durch Herunterregulierung der proinflammatorischen Zytokine TNF-α und IL-6 und Hochregulierung der entzündungshemmenden Zytokine TGF-β und IL-10 zu unterdrücken. Die verstärkte entzündungshemmende Reaktion könnte auf die hervorragende antibakterielle Aktivität von NIR-bestrahltem Ti-PDA@SNP-OGP und die immunmodulatorische Wirkung von OGP zurückzuführen sein [42]. Die In-vivo-ICP-AES-Ergebnisse legten nahe, dass Ti-PDA@SNP-OGP hauptsächlich in der Knochenmarkhöhle der Femuren verteilt war. Die Ti-PDA@SNP-OGP-Beschichtung wurde innerhalb der ersten 7 Tage schnell abgebaut, gefolgt von einem geringeren Abbau in den nächsten 21 Tagen. Diese Ergebnisse zeigten, dass Ti-PDA@SNP-OGP anhaltende Abbaueigenschaften besaß. Eine solche Funktion ist für eine verbesserte Osseointegration von Vorteil.

Mikro-CT bestätigte, dass die höchsten Prozentsätze von BV/TV, Tb.Th und Tb.N und die niedrigsten Prozentsätze von Tb.Sp in Ti-PDA@SNP-OGP gefunden wurden. Die IHC-Färbung der knochenbildenden Proteine ​​ALP, OPN und CD31 deutete darauf hin, dass NIR-bestrahltes Ti-PDA@SNP-OGP im Vergleich zu anderen Gruppen eine bessere Osteogenese aufwies, wie die höhere Expression von ALP, OPN und OCN zeigt. Insgesamt wurde aufgrund der osteoimmunmodulatorischen Wirkung von Ti-PDA@SNP-OGP gleichzeitig eine hervorragende Osseointegration erreicht.

Mehrere Einschränkungen müssen weiter angegangen werden. Der photothermische Effekt auf die physiologischen Funktionen von MSCs und RAW264.7-Zellen sollte weiter untersucht werden. Ob die bioaktiven Eigenschaften von OGP nach NIR-Bestrahlung inaktiviert werden könnten und die in vivo-Freisetzung von NO in einem infizierten Femurimplantationsmodell möglich sei, sollte gründlich untersucht werden. NO ist ein entzündliches Molekül, daher sollten die Rückkopplung von NO auf Makrophagen und seine möglichen negativen Auswirkungen auf das umliegende Gewebe weiter untersucht werden. Im Hinblick auf das Zellverhalten weist es dynamische, gekoppelte und räumlich-zeitlich regulierte Eigenschaften auf, doch die physiologischen Funktionen von MSCs und Makrophagen wurden durch unsere hergestellten Ti-Implantate als Reaktion auf räumlich-zeitliche Hinweise nicht präzise gesteuert. Daher könnte die Herstellung multifunktionaler Ti-Implantate, die eine präzise Kontrolle der physiologischen Funktionen von MSCs und RAW264.7-Zellen sowie hervorragende antibakterielle und biofilmbeseitigende Eigenschaften erreichen, ein rationalerer Ansatz für eine verbesserte Osseointegration sein.

In dieser Studie haben wir zum ersten Mal eine neuartige NIR-aktivierbare multifunktionale Schnittstelle mit ansprechendem NO-potenziertem mildem PTT und osteoimmunmodulatorischem OGP auf Ti-Implantaten vorgeschlagen, basierend auf einer PDA-vermittelten Grenzflächenfunktionalisierung, zur Beseitigung von MRSA-Biofilmen und verbesserte Osseointegration. Wir haben gezeigt, dass Ti-PDA@SNP-OGP eine ideale Plattform für die kontrollierte NO-Freisetzung ist. Insbesondere wurde NO durch eine spezielle π-π-Stapelwechselwirkung und/oder physikalische Adsorption zwischen dem SNP-Molekül und PDA auf Ti-PDA@SNP-OGP geladen. Es wurde festgestellt, dass Ti-PDA@SNP-OGP bei 808-nm-Laserbestrahlung einen starken photothermischen Effekt zeigt, der eine ideale externe Stimulationsbedingung für die kontrollierte Freisetzung von NO darstellt. Insbesondere konnte die NO-Freisetzung durch intermittierende NIR-Bestrahlung präzise gesteuert werden, was einen „Ein-Aus“-Schaltmodus zeigt.

Bei NIR-Bestrahlung zeigte Ti-PDA@SNP-OGP eine synergistische photothermische und NO-antibakterielle Wirkung, indem es das Wachstum von MRSA signifikant hemmte. Darüber hinaus wurden die durch MRSA gebildeten Biofilme durch die kombinierte Photothermie- und NO-Behandlung wirksam beseitigt. Der antibakterielle Mechanismus deutete darauf hin, dass mit Ti-PDA@SNP-OGP behandelte Bakterien durch ROS-vermittelten oxidativen Stress, Zerstörung der Bakterienmembranintegrität und Austritt von Bakterieninhalten sterilisiert wurden. In-vitro-Experimente zeigten, dass Ti-PDA@SNP-OGP nicht nur die osteogene Differenzierung von MSCs erleichterte, sondern auch M1-Makrophagen unterdrückte, während es den heilungsfördernden M2-Phänotyp stimulierte und dadurch die geschädigte Mikroumgebung in eine pro-regenerative Mikroumgebung umwandelte, die in wiederum erleichterte die Osteogenese und unterdrückte Entzündungen durch das Übersprechen mehrerer Signalwege.

Darüber hinaus eliminierte Ti-PDA@SNP-OGP in einem Rattenmodell einer implantatassoziierten Infektion die gebildeten MRSA-Biofilme, linderte die begleitende Entzündung und vermittelte die Osteoimmunmodulation, was zu einer hervorragenden Osseointegration führte. Es wird darauf hingewiesen, dass sowohl In-vitro- als auch In-vivo-Biokompatibilitätsbewertungen darauf hindeuteten, dass die Ti-PDA@SNP-OGP- und NIR-Therapie für biomedizinische Anwendungen sicher sind. Zusammenfassend bietet die Studie eine vielversprechende Strategie für die Herstellung multifunktionaler Ti-Implantate zur Beseitigung von MRSA-Biofilmen und zur Verbesserung der Osseointegration.

Die in der aktuellen Studie verwendeten Daten und Materialien sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Alkalische Phosphatase

Arginase-1

Adenosintriphosphat

Biomaterial-assoziierte Infektion

Bicinchoninsäure

Knochenmorphogenetisches Protein 2

N,N′-Disecbutyl-N,N′-dinitroso-p-phenylendiamin

Knochenvolumen im Vergleich zum gesamten Knochenvolumen

Zellzählset-8

Koloniebildende Einheit

3,3ʹ-Diaminobenzidin

2′,7′-Dichlorfluoresceindiacetat

Dulbeccos modifiziertes Eagle's Medium

Extrazelluläre Matrix

Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Extrazelluläre polymere Substanzen

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie

S-Nitrosoglutathion

Hämatokrit

Hämoglobin

Hämatoxylin und Eosin

Atomemissionsspektroskopie mit induktiv gekoppeltem Plasma

Immunhistochemie

Interleukin-6

Interleukin-10

Interleukin-1β

Viel Zusammenhalt

Jede Menge Haftung

Lipopolysaccharid

L-Arginin

Mueller-Hinton-Brühe

Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus

Stromazellen des Marks

Neutrophile Granulozyten

Nahinfrarotes Licht

Stickoxid

Diazeniumdiolate

Osteocalcin

Osteogenes Wachstumspeptid

O-Nitrophenyl-β-d-galactopyranosid

Osteopontin

Polydopamin-Nanopartikel

Blutplättchen

Photothermische Therapie

Quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion in Echtzeit

rote Blutkörperchen

Reaktive Sauerstoffspezies

Runt-bezogener Transkriptionsfaktor 2

Rasterelektronenmikroskopie

Natriumnitroprussid

Trabekelzahl

Trabekeltrennung

Dicke der Trabekelplatte

Transformierender Wachstumsfaktor-β

Titan

Tumornekrosefaktor-α

Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor

weiße Blutkörperchen

Wasserkontaktwinkel

Röntgenphotoelektronenspektroskop

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Die Autoren danken allen Studierenden und Technikern im Labor für die Mitarbeit.

Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (82101069, 82102537, 82160411, 82002278), der Natural Science Foundation of Chongqing Science and Technology Commission (CSTC2021JCYJ-MSXMX0170, CSTB2022BSXM-JCX0039) und dem First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University Cultivating Fund (PYJJ2021-02), die Beijing Municipal Science & Technology Commission (Z221100007422130) und das Youth Incubation Program of Medical Science and Technology of PLA (21QNPY116).

Yong-Lin Yu, Jun-Jie Wu und Chuan-Chuan Lin haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen

Abteilung für Pathologie, angegliedertes Krankenhaus der Zunyi Medical University, Zunyi, 563003, Guizhou, China

Yong-Lin Yu

Laborforschungszentrum, das erste angegliederte Krankenhaus der Medizinischen Universität Chongqing, Chongqing, 400016, China

Jun-Jie Wu & Bai-Long Tao

Abteilung für Bluttransfusion, Labor für Strahlenbiologie, Zweites angegliedertes Krankenhaus, Army Military Medical University, Chongqing, 400037, China

Chuan-Chuan Lin

Abteilung für reproduktive Endokrinologie, Chongqing Gesundheitszentrum für Frauen und Kinder, Chongqing, 401147, China

Xian Qin

Die Graduiertenschule, Augusta University, Augusta, GA, 30912, USA

Franklin R. Tay

Abteilung für Stomatologie, Siebtes Medizinisches Zentrum des PLA General Hospital, Peking, 100700, China

Li Miao und Yang Jiao

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LM, BLT und YJ konzipierten die Idee für die Studie, konzipierten die Experimente und interpretierten die Daten. YLY, JJW, CCL und XQ führten die Experimente durch. LM, BLT und YJ haben das Manuskript geschrieben. FRT, BLT und YJ haben das Manuskript überarbeitet. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Yong-Lin Yu, Li Miao, Bai-Long Tao oder Yang Jiao.

Alle In-vivo-Tierversuche wurden gemäß den institutionellen Richtlinien und relevanten Vorschriften für Tierversuche mit Labortieren der Medizinischen Universität Chongqing und des Siebten Medizinischen Zentrums des PLA General Hospital durchgeführt und von den Tierethikkommissionen der Medizinischen Universität Chongqing genehmigt (2021-2021). 738) und das Siebte Medizinische Zentrum des PLA General Hospital (2021-110).

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

In dieser Studie verwendete qRT-PCR-Primer für MSCs und RAW 264.7-Zellen. Abb. S1. Charakterisierung von Ti-PDA@SNP-OGP. Abb. S2. Charakterisierung des Ti-PDA@SNP-OGP-Substrats. Abb. S3. Mechanismus der Hemmung von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus-Biofilmen. Abb. S4. Biokompatibilität, Entzündungshemmung und Duplikationsbewertung von Ti oder funktionalisiertem Ti-Substrat. Abb. S5. In-vitro-Osteoimmunmodulation von Ti-PDA@SNP-OGP. Abb. S6. Antibakterielle und entzündungshemmende Bewertung in vivo. Abb. S7. Entzündungshemmende, antibakterielle Aktivität und Knochenregeneration in vivo. Abb. S8. Biosicherheit der durch PTT von Ti-PDA@SNP-OGP in vivo induzierten milden Temperatur.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Yu, YL., Wu, JJ., Lin, CC. et al. Beseitigung von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus-Biofilmen auf Titanimplantaten durch photothermisch ausgelöstes Stickstoffmonoxid und Immuntherapie für eine verbesserte Osseointegration. Military Med Res 10, 21 (2023). https://doi.org/10.1186/s40779-023-00454-y

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Eingegangen: 19. Mai 2022

Angenommen: 07. April 2023

Veröffentlicht: 04. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s40779-023-00454-y

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